腦心通對大鼠大腦中動脈閉塞模型治療機制的研究.pdf

1、研究目的：
　　1.磁共振彌散加權成像(DWI)和灌注加權成像(PWI)聯(lián)合應用，動態(tài)觀察大鼠腦梗死區(qū)的組織灌注及腦梗死體積變化情況。側面評價腦心通治療腦梗死的療效。
　　2.采用longa Zea線栓法進行大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)模型的制備，給予腦心通治療后，測定腦組織中TNF-α、MMP-9、NF-κB mRNA水平和TNF-α、MMP-9、NF-κB蛋白表達水平，探討腦心通對腦梗死的治療作用的機制。
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2、.大鼠MCAO后，測定腦組織中AQP-4 mRNA水平和蛋白表達水平，測定缺血腦組織干濕重百分比，探討腦心通對腦缺血大鼠模型腦水腫和 AQP-4表達水平的影響。
　　研究方法：
　　1.實驗動物分組與給藥：所有動物實驗過程均符合《實驗室動物使用與愛護指南》規(guī)定。健康SD雄性大鼠，體重200~220g之間，在人工控制溫度與晝夜節(jié)律的環(huán)境中飼養(yǎng)，大鼠自由飲水與飲食。所有大鼠隨機分為?假手術組：只做頸部手術，不插入線栓；?模型對照

3、組：結扎血管后予以生理鹽水給藥；?腦心通治療組：結扎血管后給予腦心通于缺血后30min給藥。每組大鼠分別按12h、1d、3d、5d、7d處死時間點分為5個亞組，每個亞組6只大鼠。給藥途徑：將腦心通膠囊內(nèi)的藥物粉末用蒸餾水溶解，稀釋成0.05g/ml濃度備用。腦心通組大鼠于術后給予步長腦心通溶液(0.45g/kg·d)灌胃(依據(jù)前期實驗基礎)；假手術組和模型對照組大鼠給予和腦心通組相等容積的生理鹽水灌胃。
　　2.動物模型制備：采用

4、Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，大鼠清醒后采用Bederson5分評分法判斷大鼠是否造模成功，評分≥2分即為造模成功。假手術組大鼠僅結扎頸部血管而不需插入線栓。
　　3. MRI檢查方法：分別于0.5d、1 d、3 d、5 d、7 d掃描磁共振，采用3.0T超導磁共振成像系統(tǒng)，大鼠專用線圈，大鼠經(jīng)水合氯醛(0.35g/kg)麻醉后，采用俯臥位，行頭顱冠狀位掃描，層厚2 mm，層間距0 mm，層數(shù)11，觀察

5、腦梗死區(qū)域變化情況。
　　4.腦組織中AQP-4、TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA的檢測：取出腦組織后，用預冷的生理鹽水沖洗后去除小腦和枕葉。取梗塞病灶周圍腦組織約100mg，放入玻璃勻漿器中，加入Trizol，提取總RNA，在M-MLV逆轉錄酶作用下合成cDNA，再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，檢測其相對表達量。
　　5. Western Blot法檢測腦梗死灶周圍腦組織中目的蛋白的表達水平：使用預冷

6、的裂解液對各組大鼠腦組織進行裂解，按蛋白提取試劑盒說明書操作提取蛋白，測定蛋白濃度后，經(jīng)SDS-PAG(10％分離膠、5%濃縮膠)凝膠電泳將蛋白分離開，再經(jīng)過轉膜電泳后蛋白轉移到PVDF膜上。帶有蛋白的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，加入配制好的一抗在37℃孵育2~4h或者4℃過夜；用TBST溶液洗膜3次后，加入配制好的二抗在37℃孵育1h。TBST洗膜3次后用化學發(fā)光液滴滿膜上，在凝膠成像系統(tǒng)經(jīng)暗室曝光，并拍照保存。用圖像分析系統(tǒng)對電泳

7、條帶進行分析，將各條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為蛋白表達的相對值。
　　6.統(tǒng)計學分析：采用SPSS16.0系統(tǒng)軟件包進行統(tǒng)計學分析，所有計量資料用均數(shù)±標準差( x±S)表示。兩樣本均數(shù)比較采用Student-t檢驗(雙尾)，多組劑量資料采用單因素方差分析(One-Way Analysis of Variance, One-Way ANOVO)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果：
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8、.磁共振檢查結果：隨著治療時間延長，模型組腦梗死體積變化不明顯；腦心通治療組腦梗死體積較模型對照組減小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　2.腦梗死大鼠腦組織的TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA的表達水平：與假手術組相比較，模型對照組TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型對照組相比較，腦心通治療組大鼠腦組織TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA表達水

9、平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.腦梗死大鼠腦組織的TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表達水平：與假手術組相比較，模型對照組TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型對照組相比較，腦心通治療組大鼠腦組織TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.腦梗死模型大鼠腦水腫情況：與假手術組相比較，模型對照組大鼠

10、腦組織 AQP-4表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型對照組相比較，腦心通治療組大鼠腦組織 AQP-4表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。腦組織含水量測定，腦心通治療組較模型對照組腦組織含水量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.腦心通對大鼠腦梗死有具有治療作用，腦梗死體積較模型對照組減少。
　　2.腦心通可以降低 MCAO大鼠腦組織的AQP4、TNF-α、MMP-9和