腦心通對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型治療機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的：
　　1.磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)和灌注加權(quán)成像(PWI)聯(lián)合應(yīng)用，動(dòng)態(tài)觀察大鼠腦梗死區(qū)的組織灌注及腦梗死體積變化情況。側(cè)面評(píng)價(jià)腦心通治療腦梗死的療效。
　　2.采用longa Zea線栓法進(jìn)行大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型的制備，給予腦心通治療后，測(cè)定腦組織中TNF-α、MMP-9、NF-κB mRNA水平和TNF-α、MMP-9、NF-κB蛋白表達(dá)水平，探討腦心通對(duì)腦梗死的治療作用的機(jī)制。
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2、.大鼠MCAO后，測(cè)定腦組織中AQP-4 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平，測(cè)定缺血腦組織干濕重百分比，探討腦心通對(duì)腦缺血大鼠模型腦水腫和 AQP-4表達(dá)水平的影響。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均符合《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用與愛護(hù)指南》規(guī)定。健康SD雄性大鼠，體重200~220g之間，在人工控制溫度與晝夜節(jié)律的環(huán)境中飼養(yǎng)，大鼠自由飲水與飲食。所有大鼠隨機(jī)分為?假手術(shù)組：只做頸部手術(shù)，不插入線栓；?模型對(duì)照

3、組：結(jié)扎血管后予以生理鹽水給藥；?腦心通治療組：結(jié)扎血管后給予腦心通于缺血后30min給藥。每組大鼠分別按12h、1d、3d、5d、7d處死時(shí)間點(diǎn)分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只大鼠。給藥途徑：將腦心通膠囊內(nèi)的藥物粉末用蒸餾水溶解，稀釋成0.05g/ml濃度備用。腦心通組大鼠于術(shù)后給予步長腦心通溶液(0.45g/kg·d)灌胃(依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ))；假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠給予和腦心通組相等容積的生理鹽水灌胃。
　　2.動(dòng)物模型制備：采用

4、Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，大鼠清醒后采用Bederson5分評(píng)分法判斷大鼠是否造模成功，評(píng)分≥2分即為造模成功。假手術(shù)組大鼠僅結(jié)扎頸部血管而不需插入線栓。
　　3. MRI檢查方法：分別于0.5d、1 d、3 d、5 d、7 d掃描磁共振，采用3.0T超導(dǎo)磁共振成像系統(tǒng)，大鼠專用線圈，大鼠經(jīng)水合氯醛(0.35g/kg)麻醉后，采用俯臥位，行頭顱冠狀位掃描，層厚2 mm，層間距0 mm，層數(shù)11，觀察

5、腦梗死區(qū)域變化情況。
　　4.腦組織中AQP-4、TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA的檢測(cè)：取出腦組織后，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后去除小腦和枕葉。取梗塞病灶周圍腦組織約100mg，放入玻璃勻漿器中，加入Trizol，提取總RNA，在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)其相對(duì)表達(dá)量。
　　5. Western Blot法檢測(cè)腦梗死灶周圍腦組織中目的蛋白的表達(dá)水平：使用預(yù)冷

6、的裂解液對(duì)各組大鼠腦組織進(jìn)行裂解，按蛋白提取試劑盒說明書操作提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，經(jīng)SDS-PAG(10％分離膠、5%濃縮膠)凝膠電泳將蛋白分離開，再經(jīng)過轉(zhuǎn)膜電泳后蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。帶有蛋白的PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，加入配制好的一抗在37℃孵育2~4h或者4℃過夜；用TBST溶液洗膜3次后，加入配制好的二抗在37℃孵育1h。TBST洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光液滴滿膜上，在凝膠成像系統(tǒng)經(jīng)暗室曝光，并拍照保存。用圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳

7、條帶進(jìn)行分析，將各條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)值。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS16.0系統(tǒng)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±S)表示。兩樣本均數(shù)比較采用Student-t檢驗(yàn)(雙尾)，多組劑量資料采用單因素方差分析(One-Way Analysis of Variance, One-Way ANOVO)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
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8、.磁共振檢查結(jié)果：隨著治療時(shí)間延長，模型組腦梗死體積變化不明顯；腦心通治療組腦梗死體積較模型對(duì)照組減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.腦梗死大鼠腦組織的TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA的表達(dá)水平：與假手術(shù)組相比較，模型對(duì)照組TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比較，腦心通治療組大鼠腦組織TNF-α、MMP-9和NF-κB mRNA表達(dá)水

9、平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3.腦梗死大鼠腦組織的TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表達(dá)水平：與假手術(shù)組相比較，模型對(duì)照組TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比較，腦心通治療組大鼠腦組織TNF-α、MMP-9和NF-κB蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.腦梗死模型大鼠腦水腫情況：與假手術(shù)組相比較，模型對(duì)照組大鼠

10、腦組織 AQP-4表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組相比較，腦心通治療組大鼠腦組織 AQP-4表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腦組織含水量測(cè)定，腦心通治療組較模型對(duì)照組腦組織含水量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.腦心通對(duì)大鼠腦梗死有具有治療作用，腦梗死體積較模型對(duì)照組減少。
　　2.腦心通可以降低 MCAO大鼠腦組織的AQP4、TNF-α、MMP-9和