藏羚羊和藏系綿羊PGC-1α基因編碼區(qū)的克隆與分析.pdf

1、研究背景與目的：
　　青藏高原是世界上海拔最高、地形最復雜的高原，平均海拔4500m，面積250萬平方公里。高寒、低壓性低氧和強紫外線輻射是青藏高原最顯著的環(huán)境特征。正是由于這片區(qū)域內(nèi)環(huán)境因素的復合作用才使得在高原上繁衍生息的諸多物種形成了它們適應高原的獨特機制。
　　藏羚羊(Pantholops hodgsonii)被稱為高原精靈，是青藏高原的特有物種，國家級保護動物，主要分布在我國的西藏羌塘、青海可可西里和新疆阿爾金山國

2、家自然保護區(qū)，棲息地海拔3600-5500m，常見于海拔4000-5000m的無人區(qū)，能以80km的時速奔跑，瞬間速度能夠達到100-120km/h。藏羚羊是青藏高原的世居動物，其進化不受物種遷徙和人工選擇的影響，是研究高原適應的理想模式動物。
　　過氧化物酶增生物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）通過與轉(zhuǎn)

3、錄因子相互作用調(diào)控下游基因的表達，參與調(diào)節(jié)線粒體生物合成、糖脂代謝、氧化磷酸化等過程。寒冷、耐力訓練等因素均可引起機體高氧化性組織器官中PGC-1α高表達。然而高原土生動物適應機制與PGC-1α關(guān)系的研究尚未見報道。
　　本課題擬以藏羚羊為研究對象，克隆并分析了能量代謝相關(guān)基因PGC-1α的編碼區(qū)序列，為從轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面深入探討藏羚羊適應高原的分子生物學機制奠定了一定的基礎。
　　研究方法：
　　經(jīng)國家林業(yè)局批準（林護許

4、準[2009]46號），2009年4月在青海省可可西里國家級自然保護區(qū)（海拔4300m）捕獲雄性藏羚羊9只；在青海省海西州野牛溝（海拔4300m）購得雄性藏系綿羊（Tibetan sheep）10只，隨后立即運至格爾木市實驗基地（海拔2800m），進行相關(guān)生理學指標的采集后，取心肌組織迅速投入液氮中，低溫保存并運回西寧。通過（美國）國家生物信息中心（NCBI）的核酸數(shù)據(jù)庫，獲取牛、山羊、人、小鼠、豬和兔的PGC-1αcDNA序列，結(jié)合D

5、NAMAN6.0和Primer Premier 5.0軟件設計引物。從藏羚羊和藏系綿羊的心肌組織中提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術(shù)擴增出目的片段，與載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴增培養(yǎng)、鑒定后測序。
　　研究結(jié)果：
　　利用生物信息學方法分析發(fā)現(xiàn)：藏羚羊和藏系綿羊的PGC-1α基因編碼區(qū)長度均為2349bp，編碼797個氨基酸；與其他脊椎動物PGC-1α基因的核苷酸及氨基酸序列相似性達到90％以上；

6、包含RNA/DNA結(jié)合位點、RNA識別基序（RRM）、與核呼吸因子1（NRF-1）及肌細胞增強因子2C（MEF2C）相互作用的區(qū)域、富含絲氨酸/精氨酸的結(jié)構(gòu)域、負調(diào)節(jié)功能結(jié)構(gòu)域、LXXLL模體以及TPPTTPP和DHDYCQ兩個保守序列，14個氨基酸差異性位點位于以上部分功能結(jié)構(gòu)域中；此外，磷酸化位點的預測提示藏羚羊可能存在一個潛在的PKG（蛋白激酶G）的磷酸化位點（第329位的蘇氨酸）。
　　結(jié)論：
　　首次成功克隆出了藏