人脂肪細(xì)胞中PGC-1的表達(dá)及調(diào)控?cái)y帶PGC-1和PGC-1 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、第一部分 人脂肪細(xì)胞中PGC-1的表達(dá)及調(diào)控 目的：胰島素抵抗(insulin resistance，IR)貫穿于2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程，是2型糖尿病發(fā)病的重要基礎(chǔ)。而脂肪組織在胰島素抵抗的發(fā)生中起著重要作用，很多資料顯示，肥胖與胰島素抵抗有高度相關(guān)性。而且，脂肪組織作為新的內(nèi)分泌器官，分泌的一些激素和細(xì)胞因子與胰島素抵抗密切相關(guān)。 過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因子α(PGC-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)

2、錄協(xié)同刺激因子。它被認(rèn)為在適應(yīng)性產(chǎn)熱、線粒體生成、脂肪酸β氧化及肝糖異生等過程中有著重要作用。肝臟中的PGC-1表達(dá)增加，能增加肝糖輸出，促進(jìn)糖異生；肌肉組織中的PGC-1可增加GLUT4的表達(dá)，通過增強(qiáng)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低血糖。 對(duì)于PGC-1與糖尿病的關(guān)系得研究，主要集中在肝臟和肌肉。而關(guān)于脂肪組織的研究尚少，因此，本研究主要觀察PGC-1在糖尿病人及正常人脂肪組織中的表達(dá)，PGC-1在體外培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控因素。

3、另外，我們還構(gòu)建了PGC-1的慢病毒表達(dá)載體及PGC-1 siRNA的慢病毒載體，觀察轉(zhuǎn)染這些構(gòu)建的慢病毒后對(duì)脂肪細(xì)胞中PGC-1下游基因的影響。 方法：RT-PCR和Western-blot檢測(cè)糖尿病人和正常人皮下脂肪組織中PGC-1的表達(dá)；流式細(xì)胞儀和油紅染色鑒定ADSCs和分化成熟的脂肪細(xì)胞；RT-PCR和Western．blot檢測(cè)TNF-α和吡咯列酮對(duì)脂肪細(xì)胞中PGC-1的影響；將PGC-1慢病毒和PGC-1 siR

4、NA慢病毒分別轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞，R1-PCR觀察轉(zhuǎn)染病毒后對(duì)脂肪細(xì)胞中PPAR-γ和GLUT4的影響。 結(jié)果：糖尿病人和正常人相比，皮下脂肪組織中PGC-1的表達(dá)顯著升高；1ng/ml的TNF-α刺激脂肪細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長，PGC-1的表達(dá)增加。而10ng/ml的TNF-α刺激脂肪細(xì)胞后，隨著時(shí)間的延長，PGC-l的表達(dá)下降；吡咯列酮處理脂肪細(xì)胞后，PGC-1的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加；PGC-l慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞后，PPAR-γ

5、和GLUT-4的表達(dá)增加。PGC-1 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞后，PPAR-γ和GLUT-4的表達(dá)下降。 結(jié)論：糖尿病人外周皮下脂肪中PGC-l的表達(dá)升高；TNF-α和吡咯列酮參與對(duì)脂肪細(xì)胞中PGC-1的調(diào)控；脂肪細(xì)胞中PGC-1能夠促進(jìn)PPAR-γ和GLUT-4的表達(dá)。 第二部分?jǐn)y帶PGC-1和PGc-1 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建與表達(dá) 目的：過氧化物酶體增生激活受體γ協(xié)同刺激因α(PGC-1)是近年來發(fā)

6、現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子。它在不同的細(xì)胞發(fā)揮著不同的作用。慢病毒載體因?yàn)槟軌蜣D(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞，攜帶的遺傳信息能夠整合到宿主的基因組，實(shí)現(xiàn)目的基因長期穩(wěn)定的表達(dá)而成為應(yīng)用范圍日益廣泛的病毒載體。因此我們構(gòu)建了PGC-1慢病毒表達(dá)載體和：PGC-1 siRNA慢病毒載體，觀察轉(zhuǎn)染病毒后對(duì)ADSCs及脂肪細(xì)胞的影響。 方法：將PGC-1全長克隆到pWPXL質(zhì)粒，PGC-1 siRNA連接到pLVTHM質(zhì)粒。包裝病毒后，流式

7、細(xì)胞儀檢測(cè)病毒滴度；MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒后對(duì)細(xì)胞的影響；RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒后PGC-1的表達(dá)。 結(jié)果：隨著病毒滴度的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸增加。病毒滴度為0.1和0.5時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有輕度刺激作用，對(duì)細(xì)胞凋亡沒有影響。病毒滴度升高后，轉(zhuǎn)染早期能抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PGC-1慢病毒載體能夠升高脂肪細(xì)胞中PGC-1的表達(dá)，PGC-1 siRNA慢病毒載體能夠抑制脂肪細(xì)胞中PGC-1的表達(dá)結(jié)論：慢病毒載體能夠長期有