柔嫩艾美耳環(huán)蟲真核翻譯起始因子3d(eIF3d)基因的研究.pdf

1、雞球蟲病是規(guī)?；B(yǎng)雞場最容易發(fā)生的寄生蟲病，它的病原體為艾美耳屬雞球蟲。雞球蟲病能夠?qū)е虑蓊惖纳L緩慢和飼料轉(zhuǎn)化率降低，間接地引起養(yǎng)殖經(jīng)濟損失，如果嚴重時，則直接導(dǎo)致雞只大量死亡，從而造成養(yǎng)殖戶的重大經(jīng)濟損失。目前，有報道表明，每年因雞球蟲病給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成了約5億英鎊的巨大損失。當(dāng)前在禽類的養(yǎng)殖業(yè)中主要還是依靠藥物來預(yù)防控制雞球蟲病，但是球蟲抗藥性的問題日益突出。同時雞體藥物殘留和藥物價格過高等問題也促使人們?nèi)ふ倚碌姆椒▉矸乐坞u

2、球蟲病。雞球蟲屬于頂復(fù)器原蟲，是專性細胞內(nèi)寄生蟲，生活史復(fù)雜，包括細胞內(nèi)階段和細胞外階段，都需要入侵雞腸道上皮細胞，在腸道細胞內(nèi)生長發(fā)育繁殖。子孢子是雞球蟲入侵腸道細胞的第一個發(fā)育階段，子孢子如何入侵，目前還不是很清楚。對子孢子階段差異表達基因的研究，有助于了解雞球蟲的入侵和生長發(fā)育機制，可為新疫苗和新藥物的研制提供新思路。本研究室前期利用抑制性消減雜交和cDNA微陣列技術(shù)篩選了柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)子孢子發(fā)育

3、階段的差異表達基因，獲得了一些ESTs。本文即以致病力最強的柔嫩艾美耳球蟲為研究對象，對獲得的其中一個子孢子差異表達基因EST(克隆號：ZB7-B08，GenBank登陸號：ES351380.1)進行克隆、表達及分析，并對其功能、免疫保護力等進行了研究。
　　 ⑴柔嫩艾美耳球蟲新基因ZB7-B08 cDNA全長的克隆及分析。本研究選擇柔嫩艾美耳球蟲子孢子差異表達基因EST(克隆號：ZB7-B08)，通過RACE技術(shù)獲得了該差異基

4、因含一個完整開放閱讀框的全長cDNA序列。在NCBI網(wǎng)站經(jīng)同源性比對，發(fā)現(xiàn)該基因與犬新孢蟲真核翻譯起始因子3第7亞單位具有68％的相似性，推測該基因為柔嫩艾美耳球蟲真核翻譯起始因子3基因(eukaryotic initiation factor3，eIF3)。此外，利用生物信息學(xué)軟件對該基因的跨膜結(jié)構(gòu)、保守域、信號肽、抗原位點、以及疏水性等進行了預(yù)測，結(jié)果顯示該基因開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)編碼571個氨

5、基酸，理論分子量約為65 KD，符合eIF3中d亞單位的命名規(guī)則，故命名該基因為EteIF3d，無跨膜結(jié)構(gòu)，也無信號肽，但有大量抗原位點。利用Real-time PCR檢測了該基因在柔嫩艾美耳球蟲4個不同發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的表達情況，結(jié)果顯示，該基因在子孢子和第二代裂殖子階段表達量相對較高，其中在第二代裂殖子階段表達最高。
　　 ⑵柔嫩艾美耳球蟲eIF3d基因的表達及抗原性驗證。將目的基因

6、EteIF3d連接到pET28b(+)原核表達載體上，成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28b-EteIF3d后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE分析重組蛋白，分子量大約69KD，在加入IPTG誘導(dǎo)后6h即達到高峰，且重組蛋白主要以無活性的包涵體形式出現(xiàn)，用尿素將其變性后，過柱純化獲得重組蛋白His-EteIF3d，經(jīng)Western-blot分析，結(jié)果表明重組蛋白EteIF3d具有良好的抗原性。為進一步對其功能進行研

7、究，需要將其進行分泌表達，因此，將該基因連接到真核畢赤酵母表達載體pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-EteIF3d后轉(zhuǎn)化GS115酵母感受態(tài)細胞，利用甲醇作為唯一碳源，誘導(dǎo)表達后獲得了有活性的可溶性蛋白，經(jīng)Western-blot驗證，畢赤酵母表達的EteIF3d蛋白具有良好的抗原性。
　　 ⑶柔嫩艾美耳球蟲eIF3d基因與入侵發(fā)育相關(guān)分析。采用間接免疫熒光實驗，將柔嫩艾美耳球蟲子孢子體外接種雞胚成纖維細胞(DF-1)后

8、，利用制備的兔抗EteIF3d多克隆抗體為一抗，分析EteIF3d在蟲體不同發(fā)育階段的定位、表達情況。結(jié)果顯示，在子孢子入侵不同時間段，EteIF3d表達量逐漸呈增加趨勢，并且剛?cè)肭旨毎麜r有向頂端聚集的趨勢，隨著子孢子的不斷發(fā)育，表達量也呈上升趨勢，到裂殖子階段表達量達到最大。推測該基因在子孢子、裂殖子的發(fā)育過程中發(fā)揮一定作用，同時也可能和子孢子、裂殖子入侵腸道上皮細胞有一定關(guān)系。為了更進一步確認該蛋白與子孢子入侵的關(guān)系，隨后又進行了該

9、蛋白的體外抑制實驗，將純化后的兔抗EteIF3d多抗IgG以不同濃度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL)與子孢子孵育2h后接入DF-1細胞，采用流式細胞儀檢測子孢子的入侵率。結(jié)果顯示，隨著抗體濃度的升高，子孢子侵入DF-1細胞的入侵率逐漸降低，說明該蛋白與子孢子入侵宿主細胞具有一定的關(guān)系。
　　 ⑷EteIF3d基因編碼蛋白對雞球蟲的免疫保護性實驗。為了驗證EteIF3d基因編碼的蛋白是否對雞

10、球蟲有較好的免疫保護效果，將重組蛋白His-EteIF3d分別以50μg/羽、100μg/羽分兩組對雛雞進行肌肉注射免疫，二免后7d用柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按1×104/羽給雞灌服，并在不同的時間段采集雞盲腸和脾臟檢測不同的指標(biāo)，最后綜合分析評價該蛋白的免疫保護性效果。結(jié)果顯示。在增重、卵囊減少率、病變記分等方面，免疫組都優(yōu)于感染對照組，并且高劑量免疫組的效果明顯更好；在體液免疫方面，His-EteIF3d免疫雞后能產(chǎn)生特異性抗體，在