EIF3D對腎細(xì)胞癌惡性增殖的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma)是腎惡性腫瘤中最常見腫瘤類型，占泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位。隨著腹部影像檢查的普及，越來越多的局限性早期腎癌被發(fā)現(xiàn)，但仍有一部分腎癌發(fā)現(xiàn)時已處于晚期階段。目前，腎癌根治術(shù)是局限性早期腎癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)。然而術(shù)后仍有部分患者出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其潛在的機(jī)制仍未知。盡管近年來的分子生物和靶向VEGFR治療的發(fā)展給晚期進(jìn)展性腎細(xì)胞癌帶來了希望，但是大約有50％的患者對

2、靶向治療不敏感，或者有大部分患者在服藥后1年左右對靶向藥物產(chǎn)生耐受。因此探索腎細(xì)胞癌治療的新靶點，增加對腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制的認(rèn)識，進(jìn)而為臨床腎細(xì)胞癌的早期診斷及預(yù)后提供依據(jù)，已成為泌尿外科的重要研究熱點。
　　EIF3D是翻譯起始因子的主要成員。作為一個相對較新的分子，目前研究報道較少，且大多僅限于腫瘤表型的研究。研究表明，EIF3D與惡性腫瘤細(xì)胞的抗凋亡相關(guān)，敲除EIF3D基因能夠抑制間皮瘤細(xì)胞的惡性增殖。通過丁型肝

3、炎病毒感染HEK-293細(xì)胞后檢測蛋白質(zhì)組的變化，發(fā)現(xiàn)EIF3D表達(dá)上調(diào)，指出EIF3D與肝癌的發(fā)生有關(guān)。也有報道表明EIF3D和腸癌、黑色素瘤以及膠質(zhì)瘤的惡性增殖有關(guān)，但尚未對其下游機(jī)制進(jìn)行深入探討。在腎細(xì)胞癌中，EIF3D的功能作用尚未闡明。為了進(jìn)一步闡釋EIF3D在腎細(xì)胞癌惡性增殖的作用機(jī)制，我們采用基因數(shù)據(jù)庫、配對新鮮腎細(xì)胞癌組織、腎細(xì)胞癌組織微陣列檢測EIF3D在腎細(xì)胞癌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平。隨后應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)敲減模

4、型在腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中沉默EIF3D后，進(jìn)行一系列腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及其下游機(jī)制的研究。
　　目的：
　　探索EIF3D在腎細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平和對腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生物學(xué)特性影響及其分子機(jī)制。
　　方法：
　?。ㄒ唬┰谀I細(xì)胞癌新鮮組織、腎細(xì)胞癌組織切片及基因數(shù)據(jù)庫中檢測EIF3D的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　于2015年1月至2015年6月在上海長征醫(yī)院泌尿外科收集20對新鮮組織腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本。所有標(biāo)本通

5、過兩種途徑保存:1、制成免疫組化檢測玻片;2、新鮮組織液氮保存。102例腎細(xì)胞癌患者組織微陣列芯片由上海市長海醫(yī)院泌尿外科贈送。以上組織標(biāo)本通過免疫組化和蛋白印跡法(Western Blot)檢測EIF3D的蛋白表達(dá)水平，并分析與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。應(yīng)用ONCOMINE基因數(shù)據(jù)庫分析EIF3D在腎細(xì)胞癌的mRNA表達(dá)水平及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　?。ǘ?、構(gòu)建沉默EIF3D慢病毒載體和刷選穩(wěn)定沉默EIF3D的腎細(xì)胞癌細(xì)胞株
　

6、　設(shè)計靶向EIF3D的shRNA序列，插入含綠色熒光報告基因(GFP)的質(zhì)粒中，構(gòu)建穩(wěn)定沉默EIF3D的慢病毒載體。應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測6種腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中EIF3D的表達(dá)水平，挑選2株高表達(dá)EIF3D細(xì)胞株作為穩(wěn)定沉默EIF3D的候選細(xì)胞株。將已重組的沉默EIF3D的慢病毒感染這2株腎細(xì)胞癌細(xì)胞，通過綠色熒光表達(dá)情況判斷感染效率，利用Real-time PCR和Western Blot檢測EIF3D的敲減效率。
　　（三）、

7、檢測穩(wěn)定沉默EIF3D腎細(xì)胞癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的腫瘤生物學(xué)特征的改變情況
　　在穩(wěn)定沉默EIF3D的腎細(xì)胞癌細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，采用MTT實驗和克隆形成實驗，檢測穩(wěn)定沉默EIF3D細(xì)胞株的細(xì)胞增殖情況和單細(xì)胞克隆形成情況。
　　（四）、探索沉默EIF3D后影響腎細(xì)胞癌細(xì)胞惡性增殖的分子機(jī)制
　　利用流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測定沉默EIF3D的腎細(xì)胞癌細(xì)胞株的細(xì)胞周期分布情況，進(jìn)行統(tǒng)計分析。再通過Western Blot

8、檢測和ONCOMINE基因數(shù)據(jù)庫分析影響細(xì)胞周期分布的調(diào)控分子，闡釋其分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┰谀I細(xì)胞癌組織中EIF3D的蛋白表達(dá)水平上調(diào)
　　通過蛋白免疫印跡方法檢測新鮮腎細(xì)胞癌與配對癌旁組織，發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌中EIF3D蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P=0.005)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌組織標(biāo)本染色較癌旁組織明顯加深，且陽性細(xì)胞數(shù)目增多，存在顯著差異(P＜0.001)。
　?。ǘ〦IF3D的表達(dá)水平與腎

9、細(xì)胞癌患者的臨床特征成正相關(guān)
　　腎細(xì)胞癌組織微陣列芯片檢測發(fā)現(xiàn)EIF3D表達(dá)水平與腫瘤大小(P=0.004)和TNM分期（P=0.03）呈顯著地正相關(guān)，且隨著EIF3D染色密度加深，TNM分期不斷增加。
　?。ㄈ├肙NC OMINE微陣列芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行EIF3D在腎細(xì)胞癌與正常腎組織的mRNA表達(dá)水平的薈萃分析
　　對5個腎細(xì)胞癌基因芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行薈萃分析，EIF3D的mRNA表達(dá)水平在腎透明細(xì)胞癌中較正常腎組織

10、顯著上調(diào)(P=0.004)。通過對腎細(xì)胞癌亞型分析發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的腎透明細(xì)胞癌（CCRCC）和腎乳頭狀細(xì)胞癌(PRCC)的EIF3D表達(dá)水平較惡性程度較低腎嫌色細(xì)胞癌(CRCC)上調(diào)(P=0.002;P=0.010)。
　?。ㄋ模┰谀I細(xì)胞癌細(xì)胞株中通過慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定敲減EIF3D基因
　　Western Blot檢測腎細(xì)胞癌細(xì)胞株，786-O和ACHN細(xì)胞株的EIF3D表達(dá)水平較其他細(xì)胞株上調(diào)。786-O和ACHN細(xì)胞株

11、感染慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默EIF3D，Real-time PCR和Western Blot驗證敲減效率，穩(wěn)定沉默EIF3D細(xì)胞株模型成功建立。
　?。ㄎ澹〦IF3D沉默顯著抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力
　　786-O和ACHN細(xì)胞在沉默EIF3D后，細(xì)胞生長曲線顯著抑制較對照組(P＜0.001)?？寺〈笮≡诔聊M和對照組顯著存在差異，且沉默組的克隆數(shù)量顯著少于對照組(786-O:P=0.0002;ACHN:P＜0

12、.0000)。
　　（六）EIF3D沉默誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌細(xì)胞G2/M期阻滯
　　786-O和ACHN細(xì)胞在沉默EIF3D后，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)發(fā)現(xiàn)EIF3D沉默組G2/M期細(xì)胞較對照組顯著上調(diào)，同時sub-G1期的細(xì)胞累積。為了驗證G2/M期阻滯的相關(guān)分子機(jī)制，Western Blot檢測周期相關(guān)下游分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默組周期相關(guān)蛋白CDK1和Cyclin B1蛋白表達(dá)水平下調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白p21和RARP裂解產(chǎn)物上調(diào)。通過ON

13、COMINE基因數(shù)據(jù)庫分析，EIF3D的表達(dá)水平與Cyclin B1(r2=0.2354，P＜0.0001)and CDK1(r2=0.1332，P=0.0003)呈現(xiàn)正相關(guān)，同時與增殖相關(guān)分子標(biāo)志物PCNA(r2=0.1687，P＜0.0001)呈現(xiàn)正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、EIF3D在腎細(xì)胞癌組織中顯著上調(diào)，且與TNM分期呈正相關(guān)。
　　2、EIF3D沉默誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌細(xì)胞G2/M期阻滯通過下調(diào)CyclinB1/