痛瀉要方對慢性應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)臟高敏感和腸道動力異常的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.觀察慢性避水應(yīng)激模型大鼠的生物學(xué)行為特征并初步探討該模型的生物學(xué)基礎(chǔ)；
　　2．觀察皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）在慢性避水應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)臟高敏感和腸道動力異常中的作用并初步探討其作用機(jī)制；
　　3.觀察痛瀉要方對應(yīng)激模型鼠的內(nèi)臟高敏感、腸道動力異常以及其他生物學(xué)行為的影響，并初步探討其中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.1）建立慢性避水應(yīng)激模型；2）觀察大鼠體重增長情況；3

2、）對大鼠進(jìn)行結(jié)直腸擴(kuò)張（colorectal distension，CRD）導(dǎo)致的腹部回縮反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）行為學(xué)評分并測量行為學(xué)為3分時的內(nèi)臟痛覺閾值以評價其內(nèi)臟敏感性；4）觀察大鼠大便性狀并統(tǒng)計應(yīng)激狀態(tài)下和基礎(chǔ)狀態(tài)下平均1小時的排便粒數(shù)以評價其腸道轉(zhuǎn)運能力；5）進(jìn)行糖水偏愛實驗和曠場實驗以評價大鼠的抑郁和焦慮狀態(tài)；6）對大鼠結(jié)腸進(jìn)行HE染色觀察其病理學(xué)改變；7）運用Elisa法檢測

3、大鼠血漿皮質(zhì)酮（CORT）水平并測量腎上腺占體重比重，以此評價其下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的活性；8）運用 Elisa法檢測大鼠血漿相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)（5-HT、SP、VIP、NO）水平以評價其內(nèi)分泌基礎(chǔ)；9）運用甲苯胺藍(lán)染色法對結(jié)腸肥大細(xì)胞進(jìn)行染色并計數(shù)。
　　2.1）復(fù)制慢性避水應(yīng)激大鼠模型，設(shè)立正常對照組、模型組以及CORT受體阻斷劑RU-486組；2)評價各組內(nèi)臟敏感性、腸道轉(zhuǎn)運能力、焦慮和抑郁行為；3)運用Elisa法

4、測定各組大鼠血漿CORT水平并測量腎上腺/體重比值；4)運用 RT-PCR檢測各組 L6-S2DRG中內(nèi)源性大麻素受體1（CB1）和瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)的mRNA表達(dá)水平, western-blot檢測各組L6-S2DRG中CB1和TRPV1蛋白表達(dá)情況。
　　3.1)復(fù)制慢性避水應(yīng)激大鼠模型，設(shè)立正常對照組、模型組、痛瀉要方高劑量組、痛瀉要方中劑量組以及痛瀉要方低劑量組；2)比較各組間：體重增長情況、內(nèi)臟敏感性

5、、腸道轉(zhuǎn)運能力、抑郁和焦慮樣行為；3)評價各組大鼠HPA軸活性、相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平（血漿5-HT、SP、NO水平）；4)RT-PCR檢測各組大鼠L6-S2DRG中CB1和TRPV1mRNA表達(dá)水平,Western-blot檢測各組大鼠L6-S2DRG中CB1和TRPV1蛋白表達(dá)水平；5)甲苯胺藍(lán)法對各組大鼠結(jié)腸組織肥大細(xì)胞進(jìn)行染色并計數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.慢性避水應(yīng)激模型組大鼠與對照組大鼠相比：1）體重增加明顯減少；2）存

6、在內(nèi)臟敏感性增加的表現(xiàn)（AWR評分明顯增加、3分行為學(xué)時的內(nèi)臟痛覺閾值明顯降低）；3）腸道轉(zhuǎn)運能力明顯增強(qiáng)（應(yīng)激狀態(tài)以及基礎(chǔ)狀態(tài)下排便粒數(shù)明顯增多）；4）存在類似抑郁和焦慮的精神活動異常狀態(tài)（糖水偏愛比明顯下降，在曠場箱中的探究行為明顯減少）；5）結(jié)腸 HE染色未見明顯的病理學(xué)損害；6）HPA軸活性增加（血漿 CORT水平明顯上升、腎上腺/體重比值明顯增加）；7）血漿5-HT、SP水平上升，NO水平下降，而VIP水平未見明顯改變；8）結(jié)

7、腸組織的肥大細(xì)胞數(shù)目明顯增加。
　　2.1）RU-486能明顯改善慢性應(yīng)激模型鼠的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)；2）RU-486能明顯降低模型鼠的腸道轉(zhuǎn)運能力；3）RU-486在一定程度上改善模型鼠的抑郁和焦慮狀態(tài)；4）慢性避水應(yīng)激模型鼠存在明顯的HPA軸活性增加，而RU-486在對模型鼠生物學(xué)行為改善的同時伴隨著對HPA軸活性的調(diào)節(jié)作用；5）慢性避水應(yīng)激模型鼠L6-S2 DRG中的CB1mRNA和蛋白水平明顯減少，而TRPV1mRNA和蛋白水

8、平明顯增加；6）RU-486可以明顯增加模型鼠 L6-S2 DRG中 CB1mRNA和蛋白水平并降低TRPV1mRNA和蛋白水平。
　　3.1)痛瀉要方可以改善慢性避水應(yīng)激模型鼠的內(nèi)臟高敏感性和腸道高轉(zhuǎn)運狀態(tài)，并有一定的抗抑郁和焦慮作用，同時伴隨內(nèi)臟高敏感和腸道動力異常等癥狀的該善，其體重增長情況也有所好轉(zhuǎn)；2）痛瀉要方可以調(diào)節(jié)HPA軸活性（降低血漿CORT水平及腎上腺/體重比值）、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌（降低血漿5-HT和SP水平、升

9、高NO水平）、提高L6-S2DRG中CB1mRNA和蛋白表達(dá)水平、降低L6-S2DRG中TRPV1mRNA和蛋白表達(dá)水平、減少結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)論：
　　1.慢性避水應(yīng)激模型能模擬臨床上IBS的內(nèi)臟高敏感和腸道動力異常改變，可以用于BS相關(guān)的內(nèi)臟感覺和腸道動力異常的研究；其中，HPA軸活性增加、相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常、結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)增加是該模型的部分生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　2.慢性避水應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)臟痛覺過敏以及腸道高轉(zhuǎn)運

10、狀態(tài)與 L6-S2DRG中CB1（下調(diào)）和TRPV1（上調(diào)）表達(dá)異常密切相關(guān)，且這一改變可能是通過CORT介導(dǎo)的。慢性避水應(yīng)激導(dǎo)致的模型鼠HPA軸過度興奮可能參與了模型鼠焦慮和抑郁情緒的形成，進(jìn)而在一定程度上影響了模型鼠的腸道癥狀。
　　3.痛瀉要方對慢性應(yīng)激模型鼠的內(nèi)臟高敏感和腸道動力異常具有明顯的改善作用，其中調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)、HPA軸興奮性進(jìn)而調(diào)控DRG中與腸道感覺和動力相關(guān)的分子CB1和TRPV1的表達(dá)可能是其內(nèi)