基于生物傳感器的MERS冠狀病毒蛋白酶檢測模型及其應(yīng)用.pdf

1、背景：新發(fā)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）嚴(yán)重威脅人類健康，致死率遠(yuǎn)高于2003年的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)，達(dá)40％以上。最近一次大爆發(fā)是去年5月份，在韓國引起了183人感染，死亡33人。冠狀病毒是一種廣泛存在，重組率高，種類繁多，主要誘發(fā)人類呼吸系統(tǒng)疾病的病毒，目前抗冠狀病毒藥物研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠?？刂撇《緩?fù)制的復(fù)制酶復(fù)合體（RC）的形成依賴其主要蛋白酶(木瓜樣蛋白酶PLpro和3C樣蛋白酶3CLpro)

2、，而這兩種蛋白酶是冠狀病毒所特有，在人體內(nèi)并沒有與其相似或相同的蛋白，抑制病毒蛋白酶催化功能就可有效抑制病毒對底物的切割，從而阻斷病毒復(fù)制。本課題設(shè)想通過構(gòu)建一個基于熒光素酶報告系統(tǒng)的生物傳感器，能夠在細(xì)胞水平對冠狀病毒蛋白酶作用機(jī)制進(jìn)行模擬，檢測蛋白酶對非結(jié)構(gòu)蛋白體的切割活性，進(jìn)一步利用該模型高靈敏度、高通量地篩選蛋白酶抑制劑。以此生物傳感系統(tǒng)及蛋白酶特異性切割的原理進(jìn)一步研究PLpro和3CLpro結(jié)構(gòu)并篩選蛋白酶抑制劑，為抗冠狀病

3、毒藥物研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的：建立基于生物傳感器的冠狀病毒蛋白酶活性測定模型，利用該模型研究人類MERS-CoV PLpro和3CLpro對催化底物及保守序列的識別特性，比較不同冠狀病毒蛋白酶活性的差異。并進(jìn)一步利用建立的模型進(jìn)行抗病毒蛋白酶抑制劑篩選，為抗人類冠狀病毒藥物篩選提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：首先，合成MERS-CoV PLpro和MERS-CoV3CLpro以及其各自底物pGlo-30F-M-nsp1/2，2/

4、3，3/4(PLpro)，4/5，5/6，6/7，7/8(3CLpro)的生物傳感器基因構(gòu)建體。其次，利用PCR定點突變試劑盒將PLpro/3CLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp(PLpro)/His-Cys(3CLpro)分別突變?yōu)锳la，從而構(gòu)建蛋白酶活性缺失突變體，同時構(gòu)建酶切底物pGlo-30F-M-nsp2/3，pGlo-30F-M-nsp7/8各識別位點的相應(yīng)突變體。再次，利用雙熒光素酶報告基因檢測法測定MER

5、S PLpro/3CLpro蛋白酶對底物的識別功能，比較不同冠狀病毒蛋白酶活性差異，并使用蛋白印跡法檢測蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。最后利用基于熒光素酶的冠狀病毒蛋白酶活性檢測的生物傳感器篩選冠狀病毒蛋白酶候選抑制劑。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建 MERS PLpro蛋白酶生物傳感器，其主要部件包括 MERS PLpro、基因工程構(gòu)建攜帶蛋白酶底物序列的傳感器質(zhì)粒，該模型作用原理是質(zhì)粒共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞表達(dá)后，蛋白酶識別切割底物，使得

6、連接底物傳感器的熒光素酶發(fā)生構(gòu)象變化，兩個亞基結(jié)合到一起，從而激活熒光素酶底物釋放熒光，一旦不識別則構(gòu)象變化受到限制，難以激活熒光素酶，釋放的熒光量顯著較低。通過檢測熒光量間接表現(xiàn)蛋白酶的活性。該模型對不同底物切割的特異性，驗證了該傳感器模型成功建立。
　　2.應(yīng)用MERS PLpro蛋白酶的生物傳感器，研究驗證MERS PLpro特異性識別切割非結(jié)構(gòu)蛋白位點：在HEK293T細(xì)胞中，MERS PLpro切割蛋白酶底物nsp2/3

7、和nsp3/4更徹底，不完全切割底物nsp1/2。分別突變MERS PLpro各個蛋白酶催化活性位點后，發(fā)現(xiàn)蛋白酶對底物的識別切割效率顯著降低。此外，實驗結(jié)果顯示當(dāng)傳感器底物pGlo-30F-M-nsp2/3的識別序列突變后，PLpro對位點LVGG的突變底物識別切割效率也明顯減弱。提示MERS-CoV PLpro特異性識別并切割底物，且識別位點高度保守序列，此切割作用依賴PLpro蛋白酶催化位點。
　　3.不同冠狀病毒PLpro

8、蛋白酶活性研究：使用MERS-CoV的傳感器底物，比較了SARS/MERS PLpro和PEDV/NL63 PLP2的識別切割效率。結(jié)果顯示，SARS和MERS兩種冠狀病毒的PLP蛋白酶存在很大相似性，而PEDV對其底物的切割效率較低，提示這種顯著的切割差異可能與病毒的種屬差異相關(guān)。
　　4.成功構(gòu)建MERS3CLpro蛋白酶生物傳感器，組成部分包括MERS3CLpro、基因工程構(gòu)建的攜帶蛋白酶底物序列傳感器質(zhì)粒，通過對底物切割，

9、驗證了3CLpro蛋白酶生物傳感器模型成功建立。應(yīng)用MERS3CLpro蛋白酶的生物傳感器，研究了MERS3CLpro特異性地切割釋放底物蛋白：在HEK293T細(xì)胞中，MERS3CLpro切割蛋白酶底物nsp5/6和nsp7/8更徹底，不完全切割底物nsp6/7。分別突變MERS3CLpro的兩個催化活性位點后，發(fā)現(xiàn)對各個蛋白酶底物的識別切割效率顯著降低。此外，實驗結(jié)果顯示當(dāng)傳感器底物pGlo-30F-M-nsp7/8的識別序列突變后，

10、3CLpro對位點LQA的突變底物識別切割效率也明顯減弱。提示MERS-CoV3CLpro特異性識別并切割底物蛋白的高度保守序列，且此切割作用依賴 PLpro蛋白酶催化位點。
　　5.不同冠狀病毒3CLpro蛋白酶活性研究：分別使用SARS和MERS兩種冠狀病毒的傳感器底物，比較了SARS和MERS3CLpro的識別切割效率。結(jié)果顯示， SARS和MERS兩種冠狀病毒的3CL蛋白酶對不同底物的切割效率的趨勢一致，由此可見冠狀病毒蛋

11、白酶功能的保守性，另外相比較而言 SARS蛋白酶的切割活性較高，也可反映出切割效率與病毒傳播快慢的關(guān)系。
　　6.基于以上研究基礎(chǔ)，本課題應(yīng)用MERS PLpro和3CLpro兩個生物傳感器篩選了大量的化合物，包括小分子抗 SARS藥物、天然提取藥物等，目前初步得到能夠抑制MERS3CLpro活性的SARS3CLpro蛋白酶抑制劑Cinaserin。
　　結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了基于生物傳感器的MERS-CoV蛋白酶活性測定模