蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因調(diào)控元件的鑒定和功能分析.pdf

1、南開大學(xué)博士學(xué)位論文蘇云金芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因調(diào)控元件的鑒定和功能分析姓名：謝池楚申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳月華2012-05摘要的大腸桿菌和B t 7 5 中都檢測(cè)不出任何伊半乳糖苷酶活性。將B t 7 5 菌株c h i A 、c M B 基因調(diào)控區(qū)域連入載體p C B ，獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入原始菌株B t 7 5 ，得到的轉(zhuǎn)化子中c h i A 、c h i B 基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá)特性與原始菌株中幾丁質(zhì)酶的誘

2、導(dǎo)合成特性一致。證明利用自行構(gòu)建的啟動(dòng)子探測(cè)型載體p C B ，完全可以開展本研究計(jì)劃的后續(xù)所有工作。通過(guò)對(duì)c h i A 調(diào)控序列的一系列缺失突變對(duì)酶活力影響的分析，發(fā)現(xiàn)調(diào)控序列從5 ’端缺失到．1 1 6b p 處或從3 ’端缺失到．4 2b p 處時(shí)啟動(dòng)子仍然保持明顯的活性，更多缺失卻導(dǎo)致啟動(dòng)子活性喪失，且只含．1 1 6 至．4 2 b p 的片段照常啟動(dòng)基因的表達(dá)，證實(shí)c h i A 結(jié)構(gòu)基因A T G 上游．1 1 6 至．

3、4 2 b p 位點(diǎn)之間長(zhǎng)7 5b p 的序列是c h i A 基因的核心啟動(dòng)子，．1 1 6b p 處的所有上游序列和．2 1 b p 處的全部下游序列對(duì)于c h i A 基因的表達(dá)和調(diào)控是非必須的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子不吻合。研究發(fā)現(xiàn)和證實(shí)在核心啟動(dòng)予下游、．2 0 b p 處上游附近存在一個(gè)應(yīng)答幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控位點(diǎn)，缺失或破壞這個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)致c h i A 啟動(dòng)子由誘導(dǎo)型表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型表達(dá)。另外，通過(guò)5 ' R A

4、C E 技術(shù)，證實(shí)在c h i A 基因核心啟動(dòng)子內(nèi)，結(jié)構(gòu)基因A T G 上游．4 6 b p 處的“A “ 堿基是c h i A 基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，由此確定c h i A 基因啟動(dòng)子的．3 5 區(qū)和．1 0 區(qū)分別為“T T A C A A ”和“T A T C A T ”。通過(guò)對(duì)c h i B 調(diào)控序列的一系列缺失突變對(duì)酶活力影響的分析，結(jié)果顯示調(diào)控序列從5 ，端缺失至．3 2 4b p 處和從3 ’缺失至．4 lb p 處時(shí)對(duì)啟

5、動(dòng)子的活性和誘導(dǎo)表達(dá)特性沒有任何影響。證明這些序列對(duì)于c h i B 基因的表達(dá)是非必須的。從5 ’端缺失至．2 3 2b p 處或從3 ’端缺失至．1 2 1b p 處時(shí)啟動(dòng)子活性降低，但仍然保持明顯的活性，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)缺失導(dǎo)致啟動(dòng)子活性完全喪失。而只含- 2 3 2 至- 1 2 1b p的片段仍然保持一定的啟動(dòng)子活性。由此證實(shí)c h i B 結(jié)構(gòu)基因A T G 上游- 2 3 2 至．1 2 1b p 位點(diǎn)之間的序列為基因的核心

6、啟動(dòng)子，與c h i A 不同，其上游及下游序列對(duì)啟動(dòng)子的活性具有一定影響。同時(shí)證實(shí)c h i B 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為結(jié)構(gòu)基因A T G 上游．1 3 2b p 處的“C ”堿基，c h i B 基因啟動(dòng)子的一3 5 區(qū)和．1 0 區(qū)序列分別為“T T T A C A ”和“T A C G A T ”。缺失分析還證明在c h i B 核心啟動(dòng)子下游、．9 7b p 處上游附近存在一個(gè)應(yīng)答幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控位點(diǎn)( d r e ) ，該位點(diǎn)