蘇云金芽胞桿菌gab基因簇表達(dá)與調(diào)控的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,簡(jiǎn)稱Bt)是農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域中應(yīng)用最為廣泛的殺蟲(chóng)微生物。Bt不同于其它芽胞桿菌的最大特點(diǎn)是,Bt在形成芽胞的同時(shí),還能產(chǎn)生具有高效殺蟲(chóng)活性的伴胞晶體蛋白。γ-氨基丁酸旁路(γ-aminobutyricacid,GABA;GABAshunt)廣泛存在于生物體內(nèi),Bt中GABAshunt相關(guān)的gab基因簇中的gabT基因和gabD基因分別編碼的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABAtrans

2、aminase,GABASE)和琥珀酸半醛脫氫酶(Suecinicsemialdhydedehydrogenase,SSADH),分別催化GABA生成琥珀酸半醛(Succinicsemialdhyde,SSA)和SSA生成琥珀酸,進(jìn)入三羧酸循環(huán)。本研究所在課題組前期發(fā)現(xiàn)Bt中g(shù)ab基因簇受σL因子控制,并受該基因簇調(diào)控基因gabR編碼產(chǎn)物GabR蛋白正調(diào)控。其GABAshunt產(chǎn)物對(duì)于Bt中g(shù)ab基因簇的轉(zhuǎn)錄影響目前尚無(wú)報(bào)道。本文主要圍

3、繞GABAshunt核心產(chǎn)物GABA和SSA對(duì)Bt中g(shù)ab基因簇轉(zhuǎn)錄的影響及其機(jī)制,以及GABAshunt阻斷和σL因子對(duì)芽胞和晶體產(chǎn)生的影響進(jìn)行列研究。
　　 通過(guò)β-半乳糖苷酶活性分析表明,GABA和SSA均能明顯誘導(dǎo)gabT基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,其中SSA的誘導(dǎo)現(xiàn)象比GABA更加明顯。而無(wú)論是GABA還是SSA均無(wú)法誘導(dǎo)gabR基因啟動(dòng)子和sigL基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性a分別在gabT,gabR、gabD和sigL四種突變體

4、HD(△gabT)、HD(△gabR)、HD(△gabD)和HD(△sigL)中轉(zhuǎn)入gabT基因啟動(dòng)子與laeZ的融合表達(dá)質(zhì)粒,在培養(yǎng)基中分別加入GABA和SSA分析各突變體中β-半乳糖苷酶活性,結(jié)果表明,加入GABA時(shí)在HD(△gabT)、HD(△gabD)中g(shù)abT基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性均高于出發(fā)菌株HD73:而加入琥珀酸半醛時(shí)HD(△gabD)中g(shù)abT基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于HD73和HD(△gabT)中g(shù)abT基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)

5、錄活性,上述結(jié)果說(shuō)明了菌體內(nèi)GABA和SSA的積累對(duì)于gabT基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性的誘導(dǎo)作用。同時(shí)結(jié)果顯示GABA和SSA對(duì)于HD(△gabR)和HO(△sigL)中g(shù)abT基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的誘導(dǎo)作用完全喪失,證明了這種誘導(dǎo)活性也是受σL因子控制,并且受GabR正調(diào)控。通過(guò)RT-PCR的結(jié)果表明,gabT基因和gabD基因在加入GABA和SSA時(shí)是共轉(zhuǎn)錄的,通過(guò)5'RACE方法確定了gabT基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。對(duì)蘇云金芽胞桿菌HD73

6、菌株中克隆了gabR和sigL基因進(jìn)行了原核表達(dá)。通過(guò)pET-21b和pGEX-4T-1載體分別構(gòu)建了這兩種基因的表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(de3)菌株中,SDS-PAGE顯示這兩個(gè)基因都分別得到了表達(dá),其中得到了GabR的純化蛋白。為進(jìn)一步研究gab基因簇的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 另一方面本研究在獲得蘇云金芽胞桿菌HD-73菌株和突變菌株的基礎(chǔ)上,分析了GABAshunt阻斷和sigL基因功能缺失對(duì)Bt生長(zhǎng)能

7、力和產(chǎn)芽孢能力的影響。結(jié)果表明,GABAshunt阻斷對(duì)Bt的生長(zhǎng)和產(chǎn)晶體蛋白能力沒(méi)有明顯的影響,卻造成了Bt產(chǎn)芽胞能力的下降,說(shuō)明GABAshunt與Bt芽胞形成有一定的關(guān)系。而生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明,在營(yíng)養(yǎng)相對(duì)貧瘠的SM培養(yǎng)基中HD73與HD(△sigL)的生長(zhǎng)差異不大,但在營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中可以觀察到兩者的顯著差異。SDS-PAGE分析結(jié)果表明了sigL,基因功能缺失明顯降低了Cry蛋白的產(chǎn)量,而β-半乳糖苷酶活性分析證明了這種表達(dá)