AMPK活化對腫瘤生物學(xué)行為和抗腫瘤治療的作用.pdf

1、背景和目的：全球癌癥死亡人數(shù)正在迅猛上升，癌癥已成為我國五大致死性疾病之首，嚴(yán)重威脅著我國人民的健康水平。能量代謝的相對平衡是抑制腫瘤細(xì)胞過度生長的預(yù)防機(jī)制，而腫瘤細(xì)胞依靠代謝重組（如 Warburg效應(yīng)）獲取能量，克服能量供應(yīng)危機(jī)。因此，腫瘤細(xì)胞的能量代謝途徑已成為腫瘤治療的潛在靶點。
　　細(xì)胞的能量代謝受多條信號通路的調(diào)控，其中單磷酸腺苷激酶（AMPK）信號通路是最重要的途徑，該通路參與調(diào)節(jié)Warburg效應(yīng)，脂肪酸的合成與谷

2、氨酰胺代謝，并與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路以及多種轉(zhuǎn)錄因子有相互作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、生長、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為，發(fā)揮抑癌作用。腫瘤發(fā)生早期，AMPKα1基因的缺失對癌基因誘發(fā)的腫瘤有促進(jìn)作用，有臨床病理資料顯示腫瘤組織中AMPK活性低于正常組織，AMPK活性不足被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一。
　　鑒于多種惡性腫瘤組織中AMPK的失活，眾多學(xué)者探索如何利用化學(xué)或生物分子激活 AMPK以抑制腫瘤生長，并取得

3、良好的效果。例如，二甲雙胍、AICAR、A769662、阿斯匹林、水楊酸，黃蓮素等化學(xué)藥物，其中關(guān)于降血糖藥物二甲雙胍的研究最為突出，現(xiàn)已作為抗癌輔助用藥進(jìn)入臨床試驗。除了化學(xué)藥物，還發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子和應(yīng)激壓力也能激活A(yù)MPK。
　　各種因素激活A(yù)MPK方式不盡相同，但AMPK的充分激活都有賴于AMPK激酶(AMPKK)的參與，目前已證實的AMPKK包括：LKB1、CaMKKβ、TAK1等。LKB1作為 AMPK最重要的上游激酶，

4、在各種腫瘤組織中表達(dá)不一，對二甲雙胍等AMPK激活劑的抗癌效果有重要影響，但目前對于LKB1在應(yīng)激壓力激活A(yù)MPK的作用尚不清楚。此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)某些應(yīng)激壓力（細(xì)胞因子刺激或化療藥物）激活A(yù)MPK的過程中，并未涉及以上AMPKK。例如，可誘導(dǎo)滲透壓改變的山梨醇。這些應(yīng)激壓力不僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，還可以引起AMPK活化，但其具體機(jī)制尚不清楚。
　　由此可見，為了提高腫瘤細(xì)胞中AMPK的活性，不僅有必要對LKB1-AMPK途徑進(jìn)

5、行深入研究，還要探索其他的AMPK激活途徑及其在抗腫瘤治療的作用。因此進(jìn)行了以下研究：⑴胃癌及肺癌組織中的p-AMPK和LKB1的表達(dá)情況；⑵LKB1過表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)行為的影響；⑶ATM和LKB1在抗癌藥物依托泊苷激活A(yù)MPK中的作用；⑷AMPK活化是否增加腫瘤細(xì)胞對依托泊苷的藥物敏感性；⑸LKB1和MLK3對AMPK的調(diào)節(jié)作用。
　　材料與方法：
　　1.本課題的臨床標(biāo)本來自南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)切

6、除標(biāo)本(倫理批準(zhǔn)號2014〔025〕)，收集60例胃癌及其對應(yīng)癌旁組織，采用免疫組化染色分析檢測胃癌及癌旁組織p-AMPK（Thr172）及LKB1的表達(dá)水平；另外，收集了65例不同階段的肺腺癌標(biāo)本，采用免疫組化染色分析不同階段的肺腺癌組織p-AMPK（Thr172）表達(dá)水平；
　　2.在缺乏LKB1蛋白的SGC-7901細(xì)胞株中轉(zhuǎn)入功能性野生型LKB1基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)LKB1的細(xì)胞株。以MTT法檢測細(xì)胞生長和存活，以細(xì)胞劃痕實

7、驗檢測細(xì)胞遷移，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期、CD44陽性表達(dá)細(xì)胞比例、細(xì)胞凋亡比率；
　　3.依托泊苷以濃度依賴或時間依賴的方式作用于前列腺癌細(xì)胞C4-2后，收集蛋白，以免疫印跡法檢測AMPK、ATM磷酸化水平；另外，siRNA干擾C4-2細(xì)胞中的ATM或LKB1，再給依托泊苷刺激后，檢測AMPK、ATM的磷酸化水平。
　　4.轉(zhuǎn)入AMPK DN突變體到C4-2細(xì)胞抑制AMPK活化（C4-2 DN），以空載體為對照（C4-2

8、 E），給依托泊苷刺激24小時，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況；選擇AMPK活性不同（C4-2 DN及C4-2 E）細(xì)胞和LKB1表達(dá)不同（A549 E及A549-LKB1）的細(xì)胞，給予依托泊苷刺激不同時間后，以免疫印跡法檢測凋亡蛋白表達(dá)（Cleaved Caspase3\Cleaved PARP）。
　　5.選擇LKB1表達(dá)不同（A549及A549-LKB1）細(xì)胞，給予各種應(yīng)激因子刺激后，以免疫印跡技術(shù)檢測p-AMPK與p-JNK

9、，篩選出同時激活A(yù)MPK與JNK的因子；在HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入MLK3質(zhì)粒，后檢測AMPK的磷酸化水平；以GSH純化技術(shù)，獲得基因重組蛋白MLK3和AMPK，以體外酶學(xué)實驗檢測MLK3對AMPK的磷酸化；在HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入MLK3質(zhì)粒后，用GSH beads將GST-MLK3蛋白捕獲，以免疫印跡檢測沉淀中是否捕獲內(nèi)源性AMPKα1或AMPKα2蛋白；將Myc-AMPK?1或?2和GST-MLK3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293

10、T細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，與GSH Beads孵育，離心沉淀，收集GSH Beads-MLK3和捕獲的蛋白，以anti-GST和anti-Myc抗體進(jìn)行免疫印跡分析。
　　結(jié)果:
　　1.胃癌及肺癌組織中AMPK和LKB1情況
　?、琶庖呓M化結(jié)果顯示胃癌組織p-AMPK（Thr172）、LKB1的表達(dá)低于癌旁組織(p<0.001)。p-AMPK（Thr172）表達(dá)：胃癌中（-）20例，（+）33例，（++）6例，（+++

11、）1例，而癌旁組織中：（-）5例，（+）11例，（++）28例，（+++）16例。LKB1表達(dá)：胃癌中（-）23例，（+）25例，（++）12例，（+++）0例，癌旁組織中LKB1表達(dá)：（-）9例，（+）13例，（++）27，（+++）11例。
　?、撇煌制诜伟┙M織中的AMPK活化情況，隨著肺腺癌分期的惡性程度增高，p-AMPK（Thr172）表達(dá)漸漸下降，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期(Spearman相關(guān)分析=-0.397, p<0.05

12、)。Ⅰ期（-）4例，Ⅰ期（+）5例，Ⅰ期（++）10例，Ⅰ期（+++）3例;Ⅱ期（-）5例，Ⅱ期（+）10例，Ⅱ期（++）9例，Ⅱ期（+++）3例;Ⅲ期（-）9例，Ⅲ期（+）8例，Ⅲ期（++）1例，Ⅲ期（+++）0例。
　　2.提高LKB1蛋白表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)行為的影響
　　在缺乏LKB1的腫瘤細(xì)胞SGC-7901中轉(zhuǎn)入LKB1基因，增加LKB1的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖與遷移，減少CD44陽性細(xì)胞的比例，

13、提高腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶和伊立替康三種抗癌藥物敏感性。
　　3. ATM和LKB1在依托泊苷激活A(yù)MPK中的作用
　　⑴Western Blot結(jié)果顯示：腫瘤細(xì)胞A549受依托泊苷刺激后，p-ATM和p-AMPK（Thr172）逐漸上升，并呈劑量和時間依賴性；
　?、苨iRNA干擾C4-2細(xì)胞的ATM表達(dá)后，ATM表達(dá)下調(diào)，給予依托泊苷刺激細(xì)胞，Western Blot結(jié)果顯示：p-ATM和p-AMPK（T

14、hr172）無明顯上升；而對照組ATM表達(dá)正常，提示依托泊苷刺激可以同時激活A(yù)TM和AMPK,依托泊苷激活A(yù)MPK過程中需要ATM的參與。
　?、莝iRNA干擾C4-2細(xì)胞的LKB1表達(dá)，LKB1表達(dá)下降，給予依托泊苷刺激細(xì)胞，Western Blot結(jié)果顯示：p-ATM表達(dá)逐漸上升，而無法激活A(yù)MPK；而對照組LKB1表達(dá)正常，依托泊苷刺激可以同時激活A(yù)TM和AMPK。提示在缺乏LKB1的條件下，依托泊苷可以激活A(yù)TM，但無法激

15、活A(yù)MPK。
　?、仍谌狈KB1的A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入LKB1基因，提高LKB1蛋白表達(dá)后，給予依托泊苷刺激細(xì)胞，Western Blot結(jié)果顯示：可以同時激活A(yù)TM和AMPK；而對照組LKB1表達(dá)無變化，依托泊苷刺激p-ATM表達(dá)逐漸上升，而無法激活A(yù)MPK。
　　以上結(jié)果提示：依托泊苷激活A(yù)MPK過程中需要ATM和LKB1共同參與。
　　4. AMPK活化對腫瘤細(xì)胞藥物敏感性的影響
　　⑴流式細(xì)胞分析顯示，

16、在依托泊苷刺激下C4-2E細(xì)胞（AMPK有活性）凋亡細(xì)胞的比例明顯高于C4-2 DN（AMPK無活性）；
　?、埔劳胁窜沾碳ず?，C4-2 E細(xì)胞中的p-AMPK（Thr172）表達(dá)、Cleaved Caspase3表達(dá)和Cleaved PARP表達(dá)明顯高于C4-2 DN細(xì)胞；
　　⑶依托泊苷刺激下，A549-LKB1細(xì)胞的p-AMPK（Thr172）表達(dá)、Cleaved Caspase3表達(dá)和Cleaved PARP表達(dá)明顯

17、高于對照組（A549 E）。
　　結(jié)果提示，AMPK活化或提高LKB1表達(dá)有助于增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性。
　　5. MLK3對AMPK的調(diào)節(jié)作用
　?、臕549-LKB1和A549-WT細(xì)胞受山梨醇、AICAR等7種因子刺激，僅在山梨醇所刺激A549-LKB1和A549-WT兩種細(xì)胞后，p-AMPK和p-JNK都升高；提示山梨醇可以同時激活A(yù)MPK和JNK,并不依賴于LKB1。
　?、艫549-LKB1和A54

18、9-WT細(xì)胞受山梨醇刺激，兩細(xì)胞的p-AMPK同時升高，提示山梨醇可能以不依賴LKB1的方式激活A(yù)MPK；
　?、窃贖EK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入MLK3質(zhì)粒，過表達(dá)MLK3蛋白，然后以免疫印跡法檢測p-AMPK（Thr172）水平，結(jié)果顯示MLK3的異常過表達(dá)可提高p-AMPK（Thr172）水平。
　?、润w外激活A(yù)MPK酶學(xué)實驗顯示，單獨(dú)加入AMP或單獨(dú)加入LKB1蛋白對AMPK的磷酸化無明顯影響；同時加入AMP和LKB1可以

19、引起AMPK的磷酸化；單獨(dú)加入MLK3可以引起明顯的AMPK磷酸化；同時加入AMP和MLK3引起的AMPK磷酸化最強(qiáng)。該結(jié)果提示MLK3可在缺乏AMP的情況下磷酸化AMPK，說明AMPK是MLK3的催化底物。
　　⑸MLK3與AMPK間的相互結(jié)合；通過Pulldown技術(shù)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入GST-MLK3質(zhì)粒的細(xì)胞提取物中發(fā)現(xiàn)AMPKα1的表達(dá)，提示轉(zhuǎn)入表達(dá)的MLK3蛋白與細(xì)胞內(nèi)源性AMPKα1亞單位緊密結(jié)合；共轉(zhuǎn)染Myc-AMPK?1或

20、?2和GST-MLK3入HEK-293T細(xì)胞，然后通過IP技術(shù)證明，外源性表達(dá)GST-MLK3蛋白能與外源性Myc-AMPK?1蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.癌組織中AMPK失活可能是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的原因之一，LKB1表達(dá)下調(diào)可使AMPK失活。在缺乏LKB1表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，提高LKB1蛋白表達(dá)可以抑制細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)發(fā)移，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性。
　　2.依托泊苷激活A(yù)MPK的過程需要ATM和LKB1共