人細(xì)小病毒B19結(jié)構(gòu)蛋白VP1獨(dú)特區(qū)多克隆抗體的制備及其磷脂酶A2活性的研究.pdf

1、人類細(xì)小病毒B19于1975年由Cossart首次發(fā)現(xiàn)于英國獻(xiàn)血人員血清中。它是目前僅有的兩種可以感染人的細(xì)小病毒之一，在全世界廣泛分布。B19病毒基因組全長約5.6kb，編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，以及兩個(gè)組成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白：VP1(84kDa)和VP2(58kDa)，兩種結(jié)構(gòu)蛋白基因是典型的重疊基因，VP1的N-末端有一個(gè)由227個(gè)氨基酸組成的VP1獨(dú)特區(qū)。最近對大約34種不同細(xì)小病毒的研究發(fā)現(xiàn)，其VP1蛋白的N-末端獨(dú)特區(qū)有一個(gè)

2、保守的結(jié)構(gòu)模型(HDXXY及YXGXG)，已有研究證明細(xì)小病毒的VP1獨(dú)特區(qū)具有磷脂酶A2活性，該活性對于病毒的復(fù)制感染是必須的，因此該區(qū)域已成為抗體藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)潛在靶標(biāo)。目前國內(nèi)對該方面的研究較少，對細(xì)小病毒B19獨(dú)特區(qū)的研究具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過定點(diǎn)突變技術(shù)對B19結(jié)構(gòu)蛋白VP1獨(dú)特區(qū)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行突變，檢測突變后該區(qū)域磷脂酶A2活性的變化，從而更加深入的研究該病毒獨(dú)特區(qū)的功能。首先，根據(jù)B19病毒VP1獨(dú)特區(qū)

3、序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到該基因連接到表達(dá)載體pMAL-c2x中，得到重組質(zhì)粒pMal-VP1u。測序正確后應(yīng)用pMALTM原核表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)帶有MBP-tag的重組融合蛋白，Amylose親和層析柱純化融合蛋白，利用pMal-c2x載體在多克隆位點(diǎn)處含有的Factor Xa酶切位點(diǎn)，將融合蛋白中標(biāo)簽蛋白MBP切除后，免疫新西蘭大白兔制備得到VP1u多克隆抗體。
　　 其次，以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒PUC-

4、VP1u作為模板，利用定點(diǎn)突變技術(shù)，PCR擴(kuò)增得到突變體克隆，測序正確后，再將含有突變位點(diǎn)的獨(dú)特區(qū)片段構(gòu)建到表達(dá)載體pMal-c2x中，獲得重組克隆pMal-mVP1u。運(yùn)用此方法，分別得到133，175，195位關(guān)鍵氨基酸突變的pMal-mVP1u。同樣的，應(yīng)用pMALTM原核表達(dá)系統(tǒng)純化得到融合蛋白，測定蛋白濃度后經(jīng)Factor Xa酶切除標(biāo)簽蛋白，體外測得磷脂酶A2活性。結(jié)果顯示，同細(xì)小病毒科其他病毒一樣，B19 VP1u具有磷脂