豬細(xì)小病毒核衣殼蛋白VP2單克隆抗體的制備及雙夾心ELISA方法的建立.pdf

1、用PK-15細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)小病毒病病毒(PPV)經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心，純化抗原免疫BALB/c小鼠。用由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的PPV-VP2基因的原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)融合表達(dá)出VP2基因蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)是所要的目的蛋白，然后粗提純的蛋白用Western-blotting檢測(cè)有較好的免疫反應(yīng)活性，將其作為間接ELISA的包被抗原建立間接ELISA，用來篩選融合后的雜交瘤細(xì)胞。取免疫BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與NS0骨

2、髓瘤細(xì)胞融合經(jīng)間接ELISA篩選，3次有限稀釋法克隆，獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗豬細(xì)小病毒核衣殼蛋白VP2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為PPV-VP2-CC1、PPV-VP2-BD2、PPV-VP2-CD12。其中只鑒定CC1株雜交瘤，經(jīng)鑒定該株雜交瘤為IgG1亞類，雜交瘤細(xì)胞的平均染色體數(shù)目為99條，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及小鼠腹水單克隆抗體的ELISA效價(jià)分別為25和211。CC1株單克隆抗體與豬繁殖-呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病

3、毒均不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示良好的特異性。連續(xù)培養(yǎng)21代，CC1雜交瘤細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌抗體。腹水經(jīng)辛酸硫酸銨純化后，蛋白含量為2.151mg/mL。此種單克隆抗體的獲得為PPV的研究、快速診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。 利用CC1雜交瘤細(xì)胞株的小鼠腹水單克隆抗體和兔抗PPVIgG建立了檢測(cè)PPV的多抗—待檢病料-單抗-二抗的雙夾心ELISA方法。經(jīng)測(cè)定，兔抗PPV高免血清單克隆抗體的最適包被濃度為4.04μg/mL(1：1600倍稀釋)