豬細小病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf

1、以純化的重組細小病毒的VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合技術，間接ELISA篩選和3次以上細胞克隆，獲得了5株穩(wěn)定分泌抗PPV VP2蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株，分別命名為2D5、1F11、2B4、3C8、1H3。5株雜交瘤細胞染色體平均數(shù)均為88±10對，分泌抗體亞類4株為IgM類，分別是1F11、2B4、3C8、1H3；1株雜交瘤細胞2D5為IgG2a，5株雜交瘤細胞2D5、1F11、2B4、3C8、1H3制備的細胞上清抗

2、體ELISA效價分別為1: 5000、1: 2000、1: 1000、1: 800、1: 800，腹水抗體效價分別為1: 106、1: 105、1: 104、1: 104、1: 104。
　　 Western blot檢測表明5株單抗均識別豬細小病毒VP2蛋白；間接免疫熒光鑒定表明5株單抗均與PPV全病毒發(fā)生反應；而不與TEGV、PRV和PEDV反應，與豬細小病毒具有較強的特異性反應。并且5株雜交瘤細胞在體外連續(xù)傳代3個月和凍存

3、后再復蘇均不能影響抗體分泌的穩(wěn)定性。實驗結果均表明，所制備的PPV VP2蛋白單克隆抗體對病原檢測具有很高的特異性，PPV VP2單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立為PPV病原基礎性研究和以此抗體建立病原特異性免疫學檢測方法奠定了重要的物質基礎。
　　 為建立細小病毒雙抗體夾心ELISA方法，制備了兔源抗豬細小病毒血清抗體。主要制備過程是用ST細胞繁殖細小病毒（PPV），經測定該病毒的TCID50為10-4.6，0.1mL，該病毒經高

4、速離心和蔗糖密度梯度離心純化后免疫家兔。對制備的單克隆抗體和多克隆抗體利用辛酸-飽和硫酸銨法和親和層析柱聯(lián)合法進行了抗體的純化，純化后的多抗?jié)舛葹?.9mg/mL，經SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，純度為100％。純化后的單抗?jié)舛葹?.23mg/mL，經SDS-PAGE電泳分析IgG重鏈和輕鏈區(qū)帶明顯，純度為100％。
　　 以純化的多抗和單克隆抗體為基本檢測試劑，進行了雙抗體夾心ELISA方法檢測病毒的探索，