哈氏噬纖維素菌纖維素降解酶的研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人類面臨著資源匱乏的巨大挑戰(zhàn)。預(yù)測(cè)地球上可利用的石油將在今后幾十年內(nèi)耗竭，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看，能源短缺將是困擾人類發(fā)展的大問題。然而，地球上最為豐富的可再生資源-纖維素卻沒有得到充分利用，常常因?yàn)槔貌划?dāng)而造成環(huán)境污染。因此，纖維素類資源的有效利用，已引起世界各國(guó)的高度重視，成為世界各國(guó)普遍重視的研究課題。 雖然纖維素材料廉價(jià)并且高產(chǎn)，但是纖維素的降解效率卻很低，尤其是結(jié)晶纖維素難以降解，造成纖維素生物轉(zhuǎn)化過程成本過

2、高，這也是纖維素利用的主要限制性因素。Cytophaga hutchinsonii具有獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制，高效的纖維素降解能力。因此，對(duì)其纖維素降解機(jī)制的闡明，將對(duì)開發(fā)新的纖維素生物降解策略以利用纖維素這一可再生資源方面有重大意義。因此本論文從C．hutchinsonii基因組出發(fā)，圍繞其高效吸附及降解纖維素的能力，初步研究了纖維素酶的催化特性及纖維素結(jié)合蛋白-碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）的結(jié)合特性。本論文主要的工作內(nèi)容及結(jié)果如下：

3、 1、C． hutchinsonii基因組中與纖維素降解相關(guān)基因序列的生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和生物軟件，對(duì)C． hutchinsonii基因組中相關(guān)的糖苷水解酶進(jìn)行了序列及結(jié)構(gòu)分析，得到的纖維素降解相關(guān)酶分布在糖苷水解酶家族GH3，GH5和GH9。 碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)C。hutchinsonii基因組中CBMs序列分析顯示，僅存在三種CBMs，分別

4、是CBM4，CBM6和CBM9，但這三種CBMs都沒有與纖維素酶串聯(lián)，大多數(shù)存在于半纖維素降解相關(guān)的酶中。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，只有CBM9可以結(jié)合結(jié)晶纖維素，因此進(jìn)一步對(duì)CBM9的序列進(jìn)行分析，最終在C．hutchinsonii中得到10個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)含有CBM9結(jié)構(gòu)域。序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，這10個(gè)CBM9又可以分為三小類，分別命名為CBM9-A，CBM9-B和CBM9-C。 2、C． hutchinsonii纖維素降解酶

5、的異源表達(dá)、分離純化及功能初步分析 由于纖維素酶的異源表達(dá)一直是纖維素酶結(jié)構(gòu)功能表征的限制性因素，缺少相對(duì)成熟的表達(dá)體系，因此我們通過采用包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和畢赤氏酵母等不同的表達(dá)體系，對(duì)C． hutchinsonii內(nèi)切纖維素酶CHU_1280及其它的纖維素降解相關(guān)酶進(jìn)行了異源表達(dá)。結(jié)果顯示，CHU_1280在大腸桿菌表達(dá)體系中成功表達(dá)，但表達(dá)量低，沒有得到純化的纖維素酶，僅能夠通過粗酶液酶活的測(cè)定來初步研究CHU_

6、1280的催化特性。CHU_1280粗酶液酶活測(cè)定結(jié)果顯示，CHU_1280有很高的CMCase，同時(shí)具有纖維寡糖酶的活性，可以將四糖降解成二糖，將五糖降解成二糖和三糖，但對(duì)于二糖和三糖沒有明顯的降解作用。 3、C． hutchinsonii碳水化合物結(jié)合模塊-CBM9對(duì)不溶性多糖、可溶性多糖、單糖及寡糖吸附作用的研究，初步確定了CBM9活性位點(diǎn)的2個(gè)氨基酸殘基的作用。 CBM是纖維素酶及纖維素吸附結(jié)合蛋白的重要組

7、成部分，在纖維素酶的降解過程中發(fā)揮著重要的作用。目前只有兩篇詳細(xì)介紹CBM9吸附特性的文章，一篇研究了CBM9與各種糖的吸附特性，另一篇通過晶體結(jié)構(gòu)解析介導(dǎo)其吸附的活性位點(diǎn)。通過異源表達(dá)C． hutchinsonii CBM9，對(duì)CBM9的吸附特性進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)其可以與不溶性木聚糖和微晶纖維素結(jié)合，其中與不溶性木聚糖的結(jié)合能力更強(qiáng)，同時(shí)CBM9還能夠與可溶性的木聚糖結(jié)合。C．hutchinsonii CBM9雖然具有三個(gè)Ca2+結(jié)

8、合位點(diǎn)，但是Ca2+濃度對(duì)CBM9結(jié)合能力并沒有影響，由此推測(cè)Ca2+沒有參與CBM9與糖的結(jié)合，而是起到一個(gè)穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。 進(jìn)一步運(yùn)用生物學(xué)軟件對(duì)C． hutchinsonii CBM9序列進(jìn)行模建。模板與C。hutchinsonii CBM9的重疊表明二者在內(nèi)部片層骨架上重合較好，發(fā)生變化的部分主要是無規(guī)卷曲形成的表面loop區(qū)。同時(shí)，與模板比較，C．hutchinsonii CBM9在結(jié)合活性位點(diǎn)區(qū)域112位多出