纖維素降解菌的分離、鑒定及產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶基因工程乳酸菌的構(gòu)建.pdf

1、纖維素酶作為飼料添加劑，可提高飼料利用率和粗飼料的營養(yǎng)價值，降低飼料成本，在促進(jìn)動物生長、減少糞便排放、改善生態(tài)環(huán)境和動物疾病防治等方面效果明顯，同時通過纖維素高效降解菌發(fā)酵處理秸稈，可以合成含有豐富蛋白質(zhì)的菌體細(xì)胞,這些分解產(chǎn)物和菌體亦可用于單細(xì)胞蛋白飼料。乳酸菌是人和動物腸道內(nèi)的常見細(xì)菌,被公認(rèn)為安全級(Generally Recognized As Safe，GRAS)微生物。它作為一種益生菌，具有維持腸道菌群微生態(tài)平衡、可激活機(jī)

2、體粘膜免疫反應(yīng)、抑制腸道內(nèi)病原微生物的生長、增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)功能。另一方面，基因工程乳酸菌可以集益生和外源基因表達(dá)的雙重功能于一身，在功能食品、醫(yī)療保健、人工口服疫苗等領(lǐng)域的應(yīng)用均具有誘人的前景。
　　 本實(shí)驗(yàn)從奶牛、山羊瘤胃內(nèi)容物以及腐爛飼草中通過羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板選擇培養(yǎng)剛果紅染色法初步篩選到能夠產(chǎn)生明顯透明圈的細(xì)菌菌株18株、真菌菌株33株，通過測定纖維素酶活性進(jìn)行復(fù)篩，分離到高效纖維素降解真

3、菌和細(xì)菌各一株作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對象，通過克隆真菌NL-3的18S rDNA序列,并以其同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建相關(guān)種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，18S rDNA序列全長504bp，Blast顯示該菌株與青霉菌屬同源；NL-3菌株在進(jìn)化關(guān)系上也與青霉菌屬(Penicillium)聚成一族。特別是與Penicillium decumbens strain JU-A10的同源性最高,其序列相似性達(dá)99％。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)與18S rDNA基因序列分析對分

4、離菌株進(jìn)行鑒定，初步鑒定為青霉屬的斜臥青霉(Penicillium decumbens)。
　　 同時克隆了細(xì)菌N9的16S rDNA序列。測序分析表明，其16S rDAN序列全長1514bp。BLAST顯示該菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)同源。以同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建了相關(guān)種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株在進(jìn)化關(guān)系上與枯草芽孢桿菌聚成一族；結(jié)合生理生化特征及16S rDNA分子鑒定，將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

5、　　 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的枯草芽孢桿菌內(nèi)切纖維素酶(eg)基因序列,針對pMG36e質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)設(shè)計引物，以枯草芽孢桿菌N9的基因組DNA為模板，擴(kuò)增eg基因序列。該基因序列全長1518bp，通過序列比對分析，eg與已報道的其它來源的內(nèi)切纖維素酶的序列相似性最高在92％。并將其亞克隆至乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pMG36e中，構(gòu)建重組乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pMG36e-eg。通過電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌MG1614感受態(tài)細(xì)

6、胞，成功構(gòu)建了產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的基因工程乳酸菌。將此重組轉(zhuǎn)化子點(diǎn)接至含CMC的M17平板上能夠產(chǎn)生透明圈，收集表達(dá)產(chǎn)物后通過進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western blot檢測到內(nèi)切纖維素酶分子量約54KD，與預(yù)期結(jié)果相吻合。
　　 本研究篩選到多株高效纖維素降解菌，并克隆了內(nèi)切纖維素酶基因(eg)，構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體pMG36e-eg，構(gòu)建了重組內(nèi)切纖維素酶基因工程乳酸菌。以期利用乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)得到高活性纖維素酶以及開發(fā)出產(chǎn)內(nèi)