糖尿病腎病患者TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化水平變化及意義的研究.pdf

1、目的:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是一種分泌型多肽分子，屬于TGF超家族。人類體內(nèi)TGF-β有3種亞型TGF-β1、2、3，其中TGF-β1在細(xì)胞中含量最為豐富，是一種多功能細(xì)胞生長(zhǎng)因子。在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)生過(guò)程中，腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是最為突出的早期表現(xiàn)，系膜細(xì)胞增殖、大量合成細(xì)胞外基質(zhì)并異常聚積，由此導(dǎo)致的腎小球硬化是DN的主要病理特征，而TGF-β1活化是導(dǎo)致系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。

2、r>　　DNA甲基化作為重要的表觀遺傳修飾方式之一，在調(diào)節(jié)DN患者腎臟纖維化和DN相關(guān)基因表達(dá)方面起到至關(guān)重要的作用。既往研究提示關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，而導(dǎo)致DN患者腎纖維化的關(guān)鍵因子，TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和DN之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題擬探討糖尿病腎病患者TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化水平變化以及與血清TGF-β1含量之間的關(guān)系，先檢測(cè)糖尿病腎病(DN)患者TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化水

3、平變化，同時(shí)觀察TGF-β1蛋白水平、炎癥因子及致纖維化因子水平、臨床生化指標(biāo)、糖尿病腎病患者腎小球病理改變情況，最后將TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化水平變化與血清TGF-β1等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析。
　　方法:選取2013年6月到2015年5月于第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院的2型糖尿病患者（依據(jù)1999年WHO修訂的糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)）101例[估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)≥30毫升/分鐘/1.73 m2]，同時(shí)排除慢

4、性腎炎、尿路感染、心力衰竭、原發(fā)性高血壓等疾病。根據(jù)尿微量白蛋白/肌酐(UACR)比值分為單純糖尿病組(DM組，UACR＜30μg/mg，n=42)，糖尿病腎病組(DN組，30μg/mg＜UACR＜300μg/mg，n=49)，氯沙坦治療糖尿病腎病組（LOS組，30μg/mg＜UACR＜300μg/mg，n=20），所有入組DN患者行腎穿刺活檢證實(shí)為糖尿病腎病。參照2010年Tervaet等提出的DN病理診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)DN組及LOS組

5、患者病理變化進(jìn)行分級(jí)。30名于我院同期體檢健康志愿者作為對(duì)照組（Con組），均排除糖尿病和其他系統(tǒng)疾病。本臨床研究獲得第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。
　　參數(shù)檢測(cè):抽提受試者外周血白細(xì)胞DNA，亞硫酸氫鈉修飾處理DNA。MSP初篩各組TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化率，BSP檢測(cè)TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)甲基化水平。檢測(cè)血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FBS)、餐后血糖(PBS)、

6、糖化血紅蛋白(HbAlc)、血清TGF-β1、C反應(yīng)蛋白(CRP)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、尿微量白蛋白/肌酐(UACR)、尿單核細(xì)胞趨化蛋白-1/肌酐(UMCR)、尿Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)，使用公式186.3×(Scr/88.4)-1.154×年齡-0.203[×0.742（若為女性）]計(jì)算eGFR。
　　結(jié)果:1.MSP法初篩TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化

7、水平的變化，Con組甲基化率為73.3％，DM組下降為42.8％，DN組進(jìn)一步下降為12.2％，組間比較均有顯著性差異。LOS組甲基化率為20％，與DN組比較也有顯著性差異。
　　2.用BSP法進(jìn)一步檢測(cè)TGF-β1基因表達(dá)調(diào)控區(qū)DNA甲基化水平的變化，發(fā)現(xiàn)Con組甲基化水平為66.7±9.1％，DM組為35.6±6.0％，DN組為12.5±8.1％，三組間均有顯著性差異。LOS組為18.7±6.2％，比DN組甲基化水平有顯著升高

8、。
　　3.ELISA檢測(cè)血清TGF-β1含量變化，Con組為296.38±74.37 ng/L，DM組為1367.22±126.13 ng/L，DN組為2885.73±411.36 ng/L，三組間有顯著性差異。LOS組血清TGFβ1含量為1523.82±173.71 ng/L，與DN組比較有顯著減少(P＜0.01)。
　　4.血清中炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，C反應(yīng)蛋白(CRP)，Con組為6.53±0.25 mg/L，DM組

9、為11.15±0.83 mg/L，DN組為19.03±2.57 mg/L，LOS組為12.84±1.62 mg/L;白細(xì)胞介素-6（IL-6），Con組為2.69±0.15 ng/L，DM組為5.02±0.19 ng/L，DN組為7.47±1.09 ng/L，LOS組為5.41±0.51 ng/L;白細(xì)胞介素-8（IL-8），Con組為54.84±2.36 ng/L，DM組為147.68±5.70 ng/L，DN組為289.09±30.

10、79 ng/L，LOS組為160.13±14.61 ng/L;腫瘤壞死因子α（TNFα），Con組為7.57±0.75 ng/L，DM組為15.83±0.63 ng/L，DN組為45.57±7.68 ng/L，LOS組為22.64±7.61 ng/L。這些指標(biāo)在Con組、DM組、DN組三組間均有顯著差異，LOS組顯著低于DN組。
　　5.尿液分析發(fā)現(xiàn)，尿Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ），Con組為39.59±12.56 pg/ng，DM組為

11、151.40±20.62 pg/ng，DN組為374.16±81.09 pg/ng，LOS組為170.63±13.43 pg/ng;尿單核細(xì)胞趨化細(xì)胞蛋白-1/肌酐比值(UMCR)，Con組為7.73±0.45μ g/L，DM組為37.14±9.03μg/L，DN組為93.59±27.68μg/L，LOS組為50.76±10.46μg/L。這些指標(biāo)在Con組、DM組、DN組三組間均有顯著差異，LOS組顯著低于DN組。
　　6.Pe

12、arson相關(guān)分析得出血清TGF-β1水平與FBS(r=0.942)、PBS(r=0.682)、BUN(r=0.479)、Scr(r=0.756)、CRP(r=0.731)、IL-6(r=0.653)、IL-8(r=0.675)、TNFα(r=0.729)、UACR(r=0.718)、UMCR(r=0.794)、Col-Ⅳ(r=0.746)呈正相關(guān)(均P＜0.01)，與eGFR(r=-0.805)和TGF-β1基因調(diào)控區(qū)甲基化水平（r=

13、-0.925）呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.01）。以UACR、FBS、PBS、UMCR、eGFR、TGF-β1基因調(diào)控區(qū)甲基化水平作為自變量，血清TGF-β1含量作為因變量，進(jìn)行多元逐步回歸分析，提示eGFR（β=-0.690，P＜0.01）和基因甲基化（β=-0.302，P＜0.01）和血清TGF-β1相關(guān)，提示它們是影響血清TGF-β1蛋白表達(dá)的因素。
　　7.血清TGF-β1蛋白水平與甲基化呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.925，P＜0.01

14、），與腎臟病理改變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)(r。=0.847，P＜0.01)。同時(shí)DN組甲基化水平和病理分級(jí)相關(guān)(x2=23.667，P=0.04)。
　　結(jié)論:1.隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，TGF-β1基因調(diào)控區(qū)甲基化水平逐漸降低，以DN組最低。同時(shí)，血清TGF-β1含量逐漸升高，以DN組最高，提示高糖可能通過(guò)誘導(dǎo)TGF-β1基因調(diào)控區(qū)去甲基化，促進(jìn)TGF-β1基因表達(dá)。
　　2.血管緊張素Ⅱ-1型受體抑制劑（氯沙坦）治療使血清TG