糖尿病腎病患者循環(huán)microRNA表達(dá)譜的分析.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)已成為全世界范圍內(nèi)終末期腎衰竭的主要病因，其發(fā)生與血流動(dòng)力學(xué)異常、多種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以及遺傳易感性等諸多因素有關(guān)。但DN的分子發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確，治療方法有待完善。尋找DN早期診斷和早期預(yù)防的標(biāo)志物，成為迫在眉睫需要解決的問題。微小核糖核酸(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)，是一類非編碼小分子單鏈RNA，與靶mRNA的3'-UTR及5'-UTR區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄

2、后調(diào)控作用，一個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)控多個(gè)基因表達(dá)，參與重要的生理和病理過程。循環(huán)miRNA存在于血清、血漿、尿液等體液中，在多種惡劣條件（如極端PH、反復(fù)凍融等）下仍然高度穩(wěn)定，目前已有相關(guān)文獻(xiàn)及報(bào)導(dǎo)指出，miRNA可作為腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病等的生物標(biāo)志物，并在診斷疾病或者判斷預(yù)后和復(fù)發(fā)，指導(dǎo)用藥和選擇治療方式中起到重要作用。但是DN患者循環(huán)miRNA的表達(dá)譜的研究目前尚未見報(bào)道。因此，我們此次試驗(yàn)將對(duì)2型糖尿病腎病患者的循環(huán)m

3、iRNA進(jìn)行研究。
　　 目的：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過分析正常對(duì)照組、糖尿病患者、DN患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜的變化，確認(rèn)在DN發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNA，從循環(huán)miRNA水平探討DN的發(fā)病機(jī)制，為糖尿病腎病早期診斷尋找新的生物標(biāo)志物。
　　 方法：
　　 采集15例個(gè)體的血清，分為3組:糖尿病腎病組(DN)，患者均為腎活檢病理明確為結(jié)節(jié)性糖尿病腎小球硬化癥（n=5，男性3人，女性2人）;糖尿病組(D

4、M)，按WHO的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)于我院確診為2型糖尿?。╪=5，男性3人，女性2人）;健康對(duì)照組(N)，均系本院健康體檢篩查者（n=5，男性3人，女性2人）。將3組個(gè)體的血清，利用AB公司Taqman human miRNA array set v3.0A+B板低密度芯片進(jìn)行芯片檢測(cè)。miR芯片結(jié)果用SYBR Green法進(jìn)行mRNA RealTime RT-PCR驗(yàn)證。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：
　　 同正常對(duì)照

5、組N相比，OGTTO分、120分在DM、DN組中呈現(xiàn)明顯增高(P＜0.01); HbAlc在DN組中顯著增高(P＜0.05);由于本次實(shí)驗(yàn)選取的DM及N組患者均為尿蛋白陰性，因此尿MA、尿A/C在DN組中呈現(xiàn)明顯增高(P＜0.001);Urea在DN組中呈現(xiàn)明顯增高(P＜0.01);血肌酐、GFR、Cys-C在正常對(duì)照組、糖尿病組、糖尿病腎病組呈現(xiàn)逐漸遞增(P＜0.05)。
　　 miRNA芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對(duì)照患者相比，

6、DM患者血清中，20個(gè)miRNA的表達(dá)上調(diào)，其中miR-572上調(diào)最明顯（4.22倍）;22個(gè)miRNA的表達(dá)下調(diào)，miR-15b下調(diào)最明顯(34.97倍)。與DM組相比，DN組miR-572下調(diào)4.61倍，miR-15b上調(diào)1.88倍。與DM組相比，DN患者血清中，42個(gè)miRNA的表達(dá)上調(diào)，其中miR-193a-5p與miR-517c上調(diào)最明顯（分別為8.07倍、7.95倍）;19個(gè)miRNA的表達(dá)下調(diào)，miR-127-3p下調(diào)最明

7、顯(28.49倍)。與N組相比，DM患者血清中miR-193a-5p下調(diào)2.09倍，miR-517c在N組中未檢測(cè)出，miR-127-3p上調(diào)3.97倍。N、DM、DN組中，miR-1179呈遞增式上調(diào)，miR-148b、miR-150呈遞減式下調(diào)。
　　 與既往文獻(xiàn)中已有的結(jié)果做對(duì)比可見，在DM/N中，循環(huán)miR-375上調(diào)(3.75倍)、miR-223下調(diào)（4倍）得到驗(yàn)證。既往文獻(xiàn)中有報(bào)道DM同N相比，一些miRNA呈現(xiàn)上調(diào)

8、或下調(diào)的表達(dá)差異，在此次實(shí)驗(yàn)中的DM/N未得到，但在DN/DM有相似變化:miR-27a(2.04倍)、miR-29a（2.02倍）、miR-152(2.04倍)、miR-28-3p（2.06倍）上調(diào)，miR-126（2.01倍）、miR-20b（2.04倍）下調(diào)。
　　 討論
　　 DN患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜的研究目前尚未見報(bào)道。
　　 本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與正常對(duì)照組相比，DM組中，20個(gè)miRNA的表達(dá)上調(diào);2

9、2個(gè)miRNA的表達(dá)下調(diào)。miR-572上調(diào)最明顯，miR-15b下調(diào)最明顯。與DM患者相比，DN組中，42個(gè)miRNA的表達(dá)上調(diào)，miR-193a與miR-517c上調(diào)最明顯;19個(gè)miRNA的表達(dá)下調(diào)，miR-127-3p下調(diào)最明顯。
　　 其中，隨著糖尿病、糖尿病腎病的進(jìn)展，miR-1179呈逐漸上調(diào)，miR-148b、miR-150呈逐漸下調(diào)。這三個(gè)miRNA有可能參與DN的發(fā)病機(jī)制，作為DN發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)記物。我們下

10、面的研究將在更大范圍的DN、DM患者血清中進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行功能性分析。
　　 通過靶基因軟件預(yù)測(cè)，miR-148b調(diào)控763個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)，其中包括:BCL2、 USP33、ZFYVE26、TGFB2、HSPA4L、PODXL、FGF2、WNT1等，廣泛參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)增生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、足細(xì)胞損傷、wnt-β信號(hào)通路等。miR-150調(diào)控287個(gè)預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)，其中包括: MAPK13、CBL、GLUT4等，廣泛參與