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文檔簡介
1、糖尿病腎病(Diabetic nephropathy, DN)已成為全世界范圍內(nèi)終末期腎衰竭的主要病因,其發(fā)生與血流動力學(xué)異常、多種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以及遺傳易感性等諸多因素有關(guān)。但DN的分子發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,治療方法有待完善。尋找DN早期診斷和早期預(yù)防的標(biāo)志物,成為迫在眉睫需要解決的問題。微小核糖核酸(microRNA,簡稱miRNA),是一類非編碼小分子單鏈RNA,與靶mRNA的3'-UTR及5'-UTR區(qū)的堿基互補(bǔ)配對,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄
2、后調(diào)控作用,一個miRNA可同時(shí)調(diào)控多個基因表達(dá),參與重要的生理和病理過程。循環(huán)miRNA存在于血清、血漿、尿液等體液中,在多種惡劣條件(如極端PH、反復(fù)凍融等)下仍然高度穩(wěn)定,目前已有相關(guān)文獻(xiàn)及報(bào)導(dǎo)指出,miRNA可作為腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病等的生物標(biāo)志物,并在診斷疾病或者判斷預(yù)后和復(fù)發(fā),指導(dǎo)用藥和選擇治療方式中起到重要作用。但是DN患者循環(huán)miRNA的表達(dá)譜的研究目前尚未見報(bào)道。因此,我們此次試驗(yàn)將對2型糖尿病腎病患者的循環(huán)m
3、iRNA進(jìn)行研究。
目的:
本實(shí)驗(yàn)通過分析正常對照組、糖尿病患者、DN患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜的變化,確認(rèn)在DN發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的miRNA,從循環(huán)miRNA水平探討DN的發(fā)病機(jī)制,為糖尿病腎病早期診斷尋找新的生物標(biāo)志物。
方法:
采集15例個體的血清,分為3組:糖尿病腎病組(DN),患者均為腎活檢病理明確為結(jié)節(jié)性糖尿病腎小球硬化癥(n=5,男性3人,女性2人);糖尿病組(D
4、M),按WHO的DM診斷標(biāo)準(zhǔn)于我院確診為2型糖尿?。╪=5,男性3人,女性2人);健康對照組(N),均系本院健康體檢篩查者(n=5,男性3人,女性2人)。將3組個體的血清,利用AB公司Taqman human miRNA array set v3.0A+B板低密度芯片進(jìn)行芯片檢測。miR芯片結(jié)果用SYBR Green法進(jìn)行mRNA RealTime RT-PCR驗(yàn)證。對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
結(jié)果:
同正常對照
5、組N相比,OGTTO分、120分在DM、DN組中呈現(xiàn)明顯增高(P<0.01); HbAlc在DN組中顯著增高(P<0.05);由于本次實(shí)驗(yàn)選取的DM及N組患者均為尿蛋白陰性,因此尿MA、尿A/C在DN組中呈現(xiàn)明顯增高(P<0.001);Urea在DN組中呈現(xiàn)明顯增高(P<0.01);血肌酐、GFR、Cys-C在正常對照組、糖尿病組、糖尿病腎病組呈現(xiàn)逐漸遞增(P<0.05)。
miRNA芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常對照患者相比,
6、DM患者血清中,20個miRNA的表達(dá)上調(diào),其中miR-572上調(diào)最明顯(4.22倍);22個miRNA的表達(dá)下調(diào),miR-15b下調(diào)最明顯(34.97倍)。與DM組相比,DN組miR-572下調(diào)4.61倍,miR-15b上調(diào)1.88倍。與DM組相比,DN患者血清中,42個miRNA的表達(dá)上調(diào),其中miR-193a-5p與miR-517c上調(diào)最明顯(分別為8.07倍、7.95倍);19個miRNA的表達(dá)下調(diào),miR-127-3p下調(diào)最明
7、顯(28.49倍)。與N組相比,DM患者血清中miR-193a-5p下調(diào)2.09倍,miR-517c在N組中未檢測出,miR-127-3p上調(diào)3.97倍。N、DM、DN組中,miR-1179呈遞增式上調(diào),miR-148b、miR-150呈遞減式下調(diào)。
與既往文獻(xiàn)中已有的結(jié)果做對比可見,在DM/N中,循環(huán)miR-375上調(diào)(3.75倍)、miR-223下調(diào)(4倍)得到驗(yàn)證。既往文獻(xiàn)中有報(bào)道DM同N相比,一些miRNA呈現(xiàn)上調(diào)
8、或下調(diào)的表達(dá)差異,在此次實(shí)驗(yàn)中的DM/N未得到,但在DN/DM有相似變化:miR-27a(2.04倍)、miR-29a(2.02倍)、miR-152(2.04倍)、miR-28-3p(2.06倍)上調(diào),miR-126(2.01倍)、miR-20b(2.04倍)下調(diào)。
討論
DN患者循環(huán)miRNA表達(dá)譜的研究目前尚未見報(bào)道。
本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):與正常對照組相比,DM組中,20個miRNA的表達(dá)上調(diào);2
9、2個miRNA的表達(dá)下調(diào)。miR-572上調(diào)最明顯,miR-15b下調(diào)最明顯。與DM患者相比,DN組中,42個miRNA的表達(dá)上調(diào),miR-193a與miR-517c上調(diào)最明顯;19個miRNA的表達(dá)下調(diào),miR-127-3p下調(diào)最明顯。
其中,隨著糖尿病、糖尿病腎病的進(jìn)展,miR-1179呈逐漸上調(diào),miR-148b、miR-150呈逐漸下調(diào)。這三個miRNA有可能參與DN的發(fā)病機(jī)制,作為DN發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)記物。我們下
10、面的研究將在更大范圍的DN、DM患者血清中進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)行功能性分析。
通過靶基因軟件預(yù)測,miR-148b調(diào)控763個預(yù)測靶基因的表達(dá),其中包括:BCL2、 USP33、ZFYVE26、TGFB2、HSPA4L、PODXL、FGF2、WNT1等,廣泛參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)增生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、足細(xì)胞損傷、wnt-β信號通路等。miR-150調(diào)控287個預(yù)測靶基因的表達(dá),其中包括: MAPK13、CBL、GLUT4等,廣泛參與
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