一種基于磁性納米顆粒和化學(xué)發(fā)光適用于自動化的高靈敏病毒檢測技術(shù)研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進(jìn)行探討：
　　1.基于磁性納米顆粒的細(xì)胞、細(xì)菌和病毒核酸提取方法研究
　　核酸提取是進(jìn)行分子生物學(xué)研究和DNA傳感器開發(fā)的關(guān)鍵步驟，核酸提取中殘留的鹽和其它有機(jī)污染物給DNA生物傳感器的開發(fā)及病原體檢測靈敏度等方面提出了挑戰(zhàn)。磁性納米顆粒(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是生物醫(yī)學(xué)中研究最多、應(yīng)用最廣的納米材料，有許多特殊性質(zhì)，在代替現(xiàn)有的病原體檢測、腫瘤標(biāo)志物檢測、疾病的體外診

2、斷等方面出現(xiàn)了很多應(yīng)用研究。本論文建立了一種基于磁分離的核酸提取技術(shù)，從血清、細(xì)胞和細(xì)菌中提取高質(zhì)量的核酸，充分利用磁分離的優(yōu)勢實現(xiàn)自動化操作。
　　實驗過程中，對鹽酸胍濃度和pH、乙醇量、洗滌液和洗脫液用量，并用PCR和電泳對提取的核酸進(jìn)行了驗證。另外，用此方法提取病毒血清時，我們還優(yōu)化了裂解液的鹽濃度和pH。結(jié)果表明，當(dāng)裂解液中GuHCI濃度達(dá)到6 mol/L時，核酸產(chǎn)量最高，同時裂解液的pH為4時提取效果最佳。本研究建立了一

3、種操作簡單的方法，能夠快速地從細(xì)胞，細(xì)菌和血清中同時提取DNA和RNA。PCR和RT-PCR結(jié)果也驗證了此方法的可靠性。使用納米顆?？梢源龠M(jìn)使用這種方法在自動化核酸提取儀的開發(fā)和應(yīng)用，為未來高通量半自動或全自動診斷系統(tǒng)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　2.基于多重PCR擴(kuò)增和化學(xué)發(fā)光乙肝和丙肝病毒的高靈敏度檢測
　　乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)是全世界威脅人類健康的最主要的疾病之一，感染了這兩種病毒會導(dǎo)致慢性肝炎，肝硬

4、化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生。因此對這一感染的早期診斷對疾病的治療以及抑制疾病傳播至關(guān)重要。目前的分子檢測系統(tǒng)不但價格昂貴，而且檢測靈敏度較低。因此，研發(fā)一種高靈敏且成本低廉的肝炎病毒診斷方法及早檢測和治療肝炎病毒，在全世界范圍尤其是發(fā)展中國家有著非常迫切的需求。本研究提出了一種通過結(jié)合磁分離、一步法逆轉(zhuǎn)錄多重PCR和化學(xué)發(fā)光技術(shù)的高靈敏、可自動化檢測臨床樣品乙肝和丙肝病毒的方法。對可能影響PCR擴(kuò)增和化學(xué)發(fā)光的因素，如引物退火溫

5、度，探針與目的序列雜交溫度，雜交時間和探針濃度等進(jìn)行了探索。多重PCR的退火溫度被確定為58℃，HBV探針雜交的最佳溫度為45℃，HCV探針雜交的最佳在溫度為55℃，最適探針濃度為5μM。當(dāng)雜交在30 min時記錄得到最大的化學(xué)發(fā)光信號。該方法成功地檢測到10拷貝/mL HBV和HCV病毒，有很高的特異性和靈敏度，可滿足臨床病毒檢測需要。
　　3.基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增、化學(xué)發(fā)光的病毒檢測方法初探
　　目前臨床上用于病毒檢測的方

6、法有很多，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實時熒光定量PCR(real-time qPCR)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)以及化學(xué)發(fā)光(CL)檢測等。在這些檢測技術(shù)中，基于核酸雜交的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于檢測乙肝、丙肝和艾滋病毒的臨床檢測。然而傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光檢測不僅需要通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來得到有效的目標(biāo)DNA，以便用于雜交，也需要長時間復(fù)雜的熱循環(huán)過程和昂貴的實驗儀器，這些方面的不足使得這一方法并不適合于醫(yī)療條件相對較低的社區(qū)

7、醫(yī)院或現(xiàn)場檢測等情況。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）能夠讓核酸在等溫的條件下快速且高特異性地進(jìn)行核酸擴(kuò)增，避免了PCR長時間復(fù)雜的熱循環(huán)過程和昂貴的實驗儀器。本論文探索了一種基于逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT-LAMP)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的辦法檢測RNA病毒。在LAMP擴(kuò)增中加入biotin-11-dUTP使擴(kuò)增產(chǎn)物帶上生物素標(biāo)記，再經(jīng)過與特異性探針雜交，最后利用ALP-AMPPD化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系判斷樣本中是否含有病毒核酸，以達(dá)到

8、病原體檢測目的。本論文優(yōu)化了LAMP擴(kuò)增和探針雜交的相關(guān)條件，如LAMP反應(yīng)溫度、雜交時間、雜交溫度、探針濃度等。確定了反應(yīng)溫度為63℃時對HA和NA基因的擴(kuò)增效率最佳;探針濃度為10μM，雜交時間為50 min時對于HA和NA探針雜交效果最佳;然而，兩種基因探針的最適雜交溫度略有不同，HA基因最佳雜交溫度為50℃，NA探針最佳雜交溫度為55℃。最后，通過靈敏度檢測實驗，我們得到本方法可以檢測出103拷貝/mL的H7N9-RNA。本方法