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文檔簡介
1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是雛鴨的一種急性致死性疾病,以肝炎和高死亡率為主要特征,病原是鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHV)。我國流行的鴨肝炎以A型鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis AVirus,DHAV-1)為主。DHAV-1由于個體很小,純化較為困難。通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備DHAV-1類病毒顆粒(virus-like particle,VLP),可以更方便的獲
2、得病毒人工抗原,通過純化,可將其用于DHAV-1的檢測,以輔助該病的預(yù)防和控制工作,亦可作為潛在的候選疫苗或以此為抗原制備單克隆抗體建立免疫學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。
小RNA病毒(Picomavirus)病毒衣殼具有相似的組裝模式,以3CD蛋白水解酶將P1結(jié)構(gòu)蛋白前蛋白切割成單一的結(jié)構(gòu)蛋白再組裝而成。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)DHV-1 JX株基因組序列,設(shè)計含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的P1基因引物,含有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的3C
3、D基因引物,以JX株RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增P1和3CD基因。隨后運(yùn)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),將DHAV-1的3CD水解酶與P1多聚蛋白基因放入同一個重組桿狀病毒(vBac-P1-3CD)中,利用單一感染的方式同時表達(dá)兩種蛋白來產(chǎn)生類病毒顆粒。利用電鏡觀察感染細(xì)胞的超薄切片,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有類病毒顆粒堆積,顆粒大小35-40nm,再結(jié)合蔗糖不連續(xù)密度梯度離心的超速離心后,獲得類病毒顆粒,負(fù)染后電鏡觀察,確認(rèn)顆粒主要以兩種
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