一種用于A型鴨甲肝病毒檢測(cè)的類(lèi)病毒顆粒制備.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是雛鴨的一種急性致死性疾病，以肝炎和高死亡率為主要特征，病原是鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)。我國(guó)流行的鴨肝炎以A型鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis AVirus，DHAV-1)為主。DHAV-1由于個(gè)體很小，純化較為困難。通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備DHAV-1類(lèi)病毒顆粒(virus-like particle，VLP)，可以更方便的獲

2、得病毒人工抗原，通過(guò)純化，可將其用于DHAV-1的檢測(cè)，以輔助該病的預(yù)防和控制工作，亦可作為潛在的候選疫苗或以此為抗原制備單克隆抗體建立免疫學(xué)診斷方法奠定基礎(chǔ)。
　　 小RNA病毒(Picomavirus)病毒衣殼具有相似的組裝模式，以3CD蛋白水解酶將P1結(jié)構(gòu)蛋白前蛋白切割成單一的結(jié)構(gòu)蛋白再組裝而成。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)DHV-1 JX株基因組序列，設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的P1基因引物，含有XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的3C

3、D基因引物，以JX株RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增P1和3CD基因。隨后運(yùn)用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將DHAV-1的3CD水解酶與P1多聚蛋白基因放入同一個(gè)重組桿狀病毒(vBac-P1-3CD)中，利用單一感染的方式同時(shí)表達(dá)兩種蛋白來(lái)產(chǎn)生類(lèi)病毒顆粒。利用電鏡觀察感染細(xì)胞的超薄切片，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有類(lèi)病毒顆粒堆積，顆粒大小35-40nm，再結(jié)合蔗糖不連續(xù)密度梯度離心的超速離心后，獲得類(lèi)病毒顆粒，負(fù)染后電鏡觀察，確認(rèn)顆粒主要以?xún)煞N