CdSe-ZnS量子點(diǎn)納米顆粒暴露的肝毒性及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:量子點(diǎn)作為一種新型納米生物材料，因其獨(dú)特而優(yōu)良的熒光特性、較小的尺寸以及表面可修飾性，正越來(lái)越多地被應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。然而，量子點(diǎn)的體內(nèi)和體外暴露表現(xiàn)出多種細(xì)胞和組織器官毒性，成為其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。肝臟是量子點(diǎn)體內(nèi)暴露后最主要的分布和蓄積器官。雖然量子點(diǎn)的肝細(xì)胞和肝臟毒性已經(jīng)被廣泛報(bào)道，但其肝細(xì)胞和肝臟毒性效應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。NLRP3(NLR pyrindomain containing3)炎癥小體是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的

2、一種細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物，可被多種病原、大分子和環(huán)境刺激物激活。激活的NLRP3炎癥小體使caspase-1活化，剪切IL-1β和IL-18成熟，并導(dǎo)致促炎性的細(xì)胞焦亡(pyroptosis)。異常激活的NLRP3炎癥小體可引起肝臟的炎癥反應(yīng)、功能損傷和纖維化。本研究以NLRP3炎癥小體為切入點(diǎn)，明確CdSe/ZnS量子點(diǎn)的肝細(xì)胞和肝臟毒性效應(yīng)，揭示NLRP3炎癥小體在其肝臟毒性中的作用，并通過(guò)線粒體活性氧(mtROS)和Ca2+信號(hào)抑制，

3、明確量子點(diǎn)激活肝細(xì)胞NRLP3炎癥小體的分子機(jī)制。
　　方法:①在表征CdSe/ZnS量子點(diǎn)理化特性的基礎(chǔ)上，量子點(diǎn)暴露L02肝細(xì)胞，檢測(cè)肝細(xì)胞對(duì)量子點(diǎn)的攝取，及其對(duì)肝細(xì)胞活力和LDH釋放的影響，明確其肝細(xì)胞毒性影響。檢測(cè)量子點(diǎn)暴露后肝細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活和肝細(xì)胞焦亡，并采用siRNA技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞NLRP3和ASC的表達(dá)進(jìn)行沉默，明確NLRP3炎癥小體在量子點(diǎn)所致的肝細(xì)胞焦亡中的作用。
　?、?0 nM/kg量子點(diǎn)尾

4、靜脈注射單次暴露C57 BL/6小鼠14天。暴露結(jié)束后檢測(cè)肝臟組織病理形態(tài)，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL1和MCP-1的表達(dá)以及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)標(biāo)志物MPO水平，并檢測(cè)血清ALT、AST、ALP和γGT水平，明確量子點(diǎn)的肝臟毒性。通過(guò)檢測(cè)NLRP3炎癥小體活化并應(yīng)用NLRP3基因敲除小鼠，明確NLRP3炎癥小體在量子點(diǎn)所致肝臟毒性中的作用。
　　③應(yīng)用ROS和mtROS抑制劑NAC和Mito-TEMPO處理L0

5、2細(xì)胞和小鼠，檢測(cè)NLRP3炎癥小體激活、肝細(xì)胞焦亡、肝臟炎癥反應(yīng)和功能損傷，明確mtROS在量子點(diǎn)所致的NLRP3炎癥小體活化、肝細(xì)胞焦亡，以及肝臟炎癥反應(yīng)和功能損傷中的作用。應(yīng)用Ca2+抑制劑2-APB和BAPTA-AM與量子點(diǎn)共處理L02細(xì)胞，檢測(cè)肝細(xì)胞mtROS生成、NLRP3炎癥小體激活和肝細(xì)胞焦亡，明確Ca2+動(dòng)員在量子點(diǎn)所致肝細(xì)胞mtROS生成、NLRP3炎癥小體激活和焦亡中的作用。
　　結(jié)果:①本研究應(yīng)用的CdSe

6、/ZnS量子點(diǎn)具有典型的量子點(diǎn)理化特征，可被L02細(xì)胞吞噬攝取。量子點(diǎn)暴露可劑量依賴性地引起肝細(xì)胞活力下降和LDH釋放增加，表明具有明顯的肝細(xì)胞毒性。量子點(diǎn)暴露激活了肝細(xì)胞NLRP3炎癥小體并引起肝細(xì)胞發(fā)生焦亡，而siRNA干擾NLRP3和ASC，可減輕量子點(diǎn)導(dǎo)致的肝細(xì)胞焦亡和LDH釋放，表明NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)了量子點(diǎn)引起的肝細(xì)胞焦亡和肝細(xì)胞毒性。
　?、诹孔狱c(diǎn)體內(nèi)暴露引起了肝組織炎性焦點(diǎn)形成、促炎因子表達(dá)上調(diào)和中性粒細(xì)胞

7、浸潤(rùn)為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致了肝臟功能的損傷。量子點(diǎn)暴露引起了肝臟NLRP3炎癥小體的激活，而量子點(diǎn)在NLRP3基因敲除小鼠中引起的肝臟炎癥反應(yīng)和功能損傷顯著輕于野生型，表明NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)了量子點(diǎn)的肝臟損傷效應(yīng)。
　?、哿孔狱c(diǎn)暴露引起了肝細(xì)胞和肝臟ROS和mtROS的生成，NAC和Mito-TEMPO顯著抑制了量子點(diǎn)引起的肝細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活和肝細(xì)胞焦亡，并且抑制了量子點(diǎn)體內(nèi)暴露導(dǎo)致的肝臟NLRP3炎癥小體激活

8、、炎癥反應(yīng)和功能損傷。量子點(diǎn)暴露導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員，2-APB和BAPTA-AM則顯著抑制了量子點(diǎn)引起的肝細(xì)胞mtROS生成、NLRP3炎癥小體激活和肝細(xì)胞焦亡。
　　結(jié)論:量子點(diǎn)激活肝細(xì)胞NLRP3炎癥小體并進(jìn)一步引起肝細(xì)胞焦亡是其導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性和肝臟損傷效應(yīng)的機(jī)制之一。量子點(diǎn)通過(guò)激活NLRP3炎癥小體引起肝細(xì)胞焦亡，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)和功能損傷。量子點(diǎn)暴露引起的肝細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員啟動(dòng)了這一效應(yīng):量子點(diǎn)引起胞質(zhì)Ca2+