負(fù)載改性BMP-2活性多肽的磷酸鈣-絲素蛋白復(fù)合體系的構(gòu)建及其成骨性能研究.pdf

1、骨科的多種疾病和創(chuàng)傷都會(huì)應(yīng)用骨移植物，常用的骨移植物包括自體骨、同種異體骨移、人工骨。自體骨是骨科骨移植物選擇的“金標(biāo)準(zhǔn)”。自體骨移植和同種異體骨移植存在相應(yīng)的缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用規(guī)模。近年來(lái)，圍繞人工骨替代材料，科研人員進(jìn)行了廣泛而深入的研究，希望最終可以替代自體骨和同種異體骨。組織工程的目標(biāo)是聯(lián)合可降解的生物材料、來(lái)源于自體組織的細(xì)胞或者具有多向分化潛能的干細(xì)胞、具有生物活性的信號(hào)分子構(gòu)建復(fù)合支架實(shí)現(xiàn)組織重建。這種治療策略在骨組織再生

2、領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景，目前研究的熱點(diǎn)集中在對(duì)骨組織損傷、疾病產(chǎn)生的骨缺損的功能性重建。
　　微球構(gòu)成支架結(jié)構(gòu)的方式主要有兩種：一、將獨(dú)立分開(kāi)的微球彼此之間緊密壓配形成支架結(jié)構(gòu)；二、將微球混入支架主要成份中，用于負(fù)載活性分子、細(xì)胞。因?yàn)棣?磷酸三鈣（α-tricalcium phosphate，α-TCP）與正常骨基質(zhì)中無(wú)機(jī)成份羥基磷灰石相似，所以在骨組織再生工程中被廣泛使用。但是，通過(guò)煅燒的方式制備α-TCP無(wú)機(jī)微球，難以控制

3、微球的形狀和大小，將絲素蛋白（Silk fibroin，SF）溶液作為粘合劑混合磷酸鈣粉末，得到可注射的α-磷酸鈣/絲素蛋白（α-TCP/SF）骨水泥漿，容易通過(guò)其它處理方法（如乳化法、高壓靜電場(chǎng)分散法等）得到微米級(jí)別和納米級(jí)別的微球，微球大小均一，而且產(chǎn)量穩(wěn)定。
　　磷酸鈣材料本身生物相容性好、可降解、具有一定的力學(xué)強(qiáng)度，但是主要存在誘導(dǎo)成骨能力不足的問(wèn)題。常規(guī)的解決方法是將材料負(fù)載具有誘導(dǎo)成骨能力的生長(zhǎng)因子。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（B

4、one morphogenetic protein-2，BMP-2）是廣為認(rèn)可的具有良好的誘導(dǎo)成骨能力的生長(zhǎng)因子，局部過(guò)高濃度的BMP-2可導(dǎo)致異位成骨、致腫瘤發(fā)生。源于BMP-2活性結(jié)構(gòu)域的多肽能保留蛋白的誘導(dǎo)成骨活性，減少相關(guān)副反應(yīng)的發(fā)生。多肽經(jīng)物理沉積吸附于材料表面，容易產(chǎn)生“突釋”釋放且持續(xù)時(shí)間短暫。磷酸鈣缺乏與生物大分子共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)，連續(xù)的多聚谷氨酸基團(tuán)（polyglutamate，“E7”）帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷，修飾多肽后可以

5、與磷酸鈣材料水解后形成的二價(jià)陽(yáng)離子—鈣離子形成牢固的離子鍵，提高磷酸鈣對(duì)多肽的負(fù)載效率和釋放效果。
　　本文旨在構(gòu)建緩慢持續(xù)釋放改性BMP-2活性多肽的α-TCP/SF微球，體外評(píng)估微球負(fù)載多肽的效率和釋放效果，并在體外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中考察這一體系的促成骨作用。本研究共分為四個(gè)部分：第一部分，α-TCP/SF微球的制備和表征；第二部分，E7BMP-2多肽的負(fù)載和釋放；第三部分，α-TCP/SF微球+ E7BMP-2多肽的體外促成骨評(píng)估；

6、第四部分，α-TCP/SF微球+E7BMP-2多肽的體內(nèi)促成骨評(píng)估。
　　從本研究中我們得出如下的結(jié)果和結(jié)論：（1）通過(guò)高壓靜電場(chǎng)分散液氮冷卻可以簡(jiǎn)單有效的制備α-TCP/SF微球。微球粒徑分布于200μm～500μm，產(chǎn)量穩(wěn)定；可以用于大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用；（2）E7BMP-2多肽釋放持續(xù)時(shí)間可達(dá)3周，早期釋放無(wú)“突釋”。α-TCP/SF微球+E7BMP-2多肽是長(zhǎng)期緩慢釋放生長(zhǎng)因子的體系；（3）在誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

7、成骨分化的過(guò)程中，α-TCP/SF微球+E7BMP-2多肽的緩釋體系促進(jìn)成骨相關(guān)基因Runx2、ALP、OCN的表達(dá)，E7BMP-2多肽在這一系列過(guò)程中沒(méi)有喪失生物活性；（4）構(gòu)建的α-TCP/SF微球+E7BMP-2多肽/PVA支架具有一定的力學(xué)強(qiáng)度。經(jīng)過(guò)組織學(xué)、影像學(xué)結(jié)果證實(shí)，在造模后的第8、12周，填充具有誘導(dǎo)成骨能力的材料的組別，大鼠顱骨缺損區(qū)有一定量的骨組織形成，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨量增加。
　　E7BMP-2多肽吸附于