羥基磷灰石-絲素復(fù)合支架負(fù)載BMP-2的制備及其生物相容性研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)隸屬于轉(zhuǎn)錄生長因子β(TGF-β)超家族，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、誘導(dǎo)骨組織再生的能力，目前已廣泛應(yīng)用于骨組織工程研究之中。羥基磷灰石(HA)是天然骨組織的主要無機(jī)成分，具有骨誘導(dǎo)性，能夠誘導(dǎo)新生骨的血管化，促進(jìn)新骨的形成，且植入體內(nèi)后不會引起炎癥反應(yīng)，常用作骨修復(fù)材料。絲素蛋白(SF)因其良好的生物相容性、降解性及獨(dú)特的力學(xué)性能等，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白

2、2(rhBMP-2)的表達(dá)，獲得了有生物活性的BMP2成熟肽。在此基礎(chǔ)上將rhBMP-2與HA及SF復(fù)合，制備了負(fù)載有rhBMP-2的HA/SF復(fù)合支架，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，研究該材料的生物相容性及對骨缺損修復(fù)的影響。本研究主要包括三部分內(nèi)容：
　　 1、重組人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的體外表達(dá)、純化及復(fù)性
　　 通過逆轉(zhuǎn)錄PCR方法從人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中獲得rhBMP-2基因，克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)中構(gòu)建了

3、表達(dá)質(zhì)粒pET30a-rhBMP2。將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，變性條件下利用Ni離子親和層析(Ni-NTA)柱進(jìn)一步純化目的蛋白，4℃不同pH值條件下尿素梯度透析復(fù)性蛋白。將MG-63細(xì)胞與rhBMP-2共培養(yǎng)，檢測蛋白活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ni-NTA柱可以純化rhBMP-2，產(chǎn)量為58 mg/L培養(yǎng)基(4.8 mg/g細(xì)胞濕重)。蛋白復(fù)性產(chǎn)率隨復(fù)性液pH值增大而增加。當(dāng)復(fù)性液pH值為6.0時產(chǎn)率僅

4、為3.4％，而pH7.4條件下復(fù)性產(chǎn)率為42％，pH9.0條件下可達(dá)96％。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pH9.0條件下獲得的rhBMP-2相比，pH7.4條件下復(fù)性的rhBMP-2蛋白活性更強(qiáng)，能夠顯著促進(jìn)MG-63細(xì)胞的增殖與分化。這主要是由于pH7.4更接近于人體生理?xiàng)l件，可促進(jìn)目的蛋白形成二聚體，因此獲得活性更強(qiáng)目的蛋白。
　　 2、負(fù)載rhBMP-2的HA/SF復(fù)合支架的制備
　　 本研究通過化學(xué)沉淀法合成了HA粉末，

5、將其與SF共混后通過冷凍干燥法制備了HA/SF支架。利用SEM、XRD、FT-IR以及TGA等方法對復(fù)合支架進(jìn)行表征。通過浸漬法將rhBMP-2與HA/SF支架復(fù)合，并在體外研究復(fù)合支架對rhBMP-2的吸附及釋放。結(jié)果表明，本研究制備的HA/SF支架具有多孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布在200μm左右，孔間連通性較好。HA顆?？稍谥Ъ苤芯鶆蚍植?，無明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。XRD及FT-IR分析表明SF在復(fù)合支架中是以β-折疊構(gòu)象存在。蛋白的體外吸附及釋放實(shí)驗(yàn)

6、表明，可通過調(diào)節(jié)浸漬液中目的蛋白濃度來控制rhBMP-2在復(fù)合支架中的負(fù)載量，復(fù)合后的rhBMP-2可以在較長時間內(nèi)從HA/SF復(fù)合支架中持續(xù)釋放。
　　 3、負(fù)載rhBMP-2的HA/SF復(fù)合支架的生物相容性研究
　　 本研究利用MG-63細(xì)胞研究復(fù)合支架在體外對細(xì)胞粘附、增殖及分化的影響。構(gòu)建大鼠的顱骨缺陷模型，將復(fù)合支架移植于缺損處，觀察支架對骨缺損修復(fù)的影響。通過將復(fù)合支架植入大鼠大腿肌肉中，檢測支架對異位骨形成