IGFBp-1參與老齡促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的作用和機(jī)制.pdf

1、冠心病是世界上發(fā)病率和病死率最高的疾病之一，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要病理改變。老齡是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它通過對(duì)血管壁細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)促進(jìn)血管壁重塑，進(jìn)而使動(dòng)脈粥樣硬化加重。老齡通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的衰老和凋亡使血管內(nèi)皮功能受損，啟動(dòng)和加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　老齡可以通過多條信號(hào)途徑參與血管壁的重塑。有文獻(xiàn)報(bào)道年齡相關(guān)的組織修復(fù)能力異?？赡芘cNotch信號(hào)途徑有關(guān)，因此與生長(zhǎng)、發(fā)育相關(guān)的Notch信號(hào)可

2、能在血管衰老的調(diào)節(jié)中起到了一定的作用。為了了解Notch信號(hào)在老齡調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞衰老、增殖中的作用，我們進(jìn)行了前期研究，發(fā)現(xiàn)老年小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Notch配體Jagged1表達(dá)下調(diào)是老齡促進(jìn)血管壁增厚的重要原因，而且內(nèi)皮細(xì)胞Jagged1表達(dá)下調(diào)能顯著減少可溶性分泌蛋白:胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(insulin-like growthfactor-binding protein1，IGFBP-1)的表達(dá)，因此提示IGFBP-1可能

3、參與了老齡促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的過程。
　　IGFBP-1主要由肝臟合成，屬于胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)家族中的一員。IGFBPs是由6種具有高度同源性的蛋白質(zhì)組成的蛋白家族。他們主要是通過對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF-2)生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)在多種疾病中發(fā)揮作用，IGFBPs同時(shí)也具有獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)。IGFBP-1作為IGFBPs家族中的一員不僅依賴于對(duì)IGF-Ⅰ生物學(xué)活性的急性調(diào)節(jié)

4、在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮作用，同時(shí)IGFBP-1還能通過不依賴于IGF-Ⅰ的途徑來參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。但I(xiàn)GFBP-1在動(dòng)脈粥樣硬化中的獨(dú)立效應(yīng)目前尚無明確報(bào)道。
　　有研究表明IGFBP-1與體重指數(shù)(BMI)、血糖、血脂等多種心血管疾病危險(xiǎn)因素呈負(fù)相關(guān)，IGFBP-1濃度降低能獨(dú)立預(yù)測(cè)致死性缺血性心肌病的發(fā)生。但也有文獻(xiàn)報(bào)道IGFBP-1濃度升高與心血管疾病的死亡率增加相關(guān)。因此IGFBP-1在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用尚存在一定爭(zhēng)

5、議。本研究旨在對(duì)IGFBP-1與年齡和與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系進(jìn)行探索，并試圖通過觀察IGFBP-1對(duì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、衰老、凋亡的影響，探索IGFBP-1參與老齡促進(jìn)動(dòng)脈粥樣的可能機(jī)制。
　　目的:通過分析IGFBP-1水平與年齡和冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系，探討IGFBP-1在老齡促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化中的作用;通過觀察IGFBP-1對(duì)人冠脈動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)增殖、衰老、凋亡的影響，探討IGFBP-1參與老齡促進(jìn)

6、動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制。
　　方法:第一部分:
　　根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)選取于2014年7月至2015年7月因急性胸痛就診于新橋醫(yī)院，疑診為急性冠脈綜合征且擬行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)的患者共112名作為受試者。排除糖尿病、惡性腫瘤、心肌病、心臟瓣膜病、主動(dòng)脈瘤、穩(wěn)定性心絞痛、自身免疫性疾病、感染、嚴(yán)重肝腎功能不全以及既往行冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架植入術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)患者。
　　第二部分:
　　1.培養(yǎng)HCAEC，用si-Jagged

7、1轉(zhuǎn)染HCAEC，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timefluorescent quantitative PCR)、Westem-Blot、以及ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-Jagged1后HCAEC的Jagged1、IGFBP-1的表達(dá)情況。
　　2.用不同濃度的IGFBP-1(0ng/ml，5ng/ml，50ng/ml和100ng/ml)處理HCAEC，用CCK-8法和3H-TdR摻入法檢測(cè)各組HCAEC的增殖能力。
　　3

8、.根據(jù)HCAEC的傳代情況以及有無H2O2(100umol/L)、IGFBP-1(50ng/ml)處理，分為第5代(P5)組第20代(P20)組，空白對(duì)照組、IGFBP-1組，H2O2組和IGFBP-1+H2O2組。用衰老相關(guān)β-gal染色檢測(cè)各組HCACE的衰老率。
　　4.根據(jù)有無H2O2（600umol/L）、IGFBP-1(50ng/ml)處理分為空白對(duì)照組、IGFBP-1組，H2O2組和IGFBP-1+H2O2組。用An

9、nexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞雙染檢測(cè)HCAEC的凋亡率。
　　5.Western-Blot檢測(cè)不同濃度(0ng/ml，5ng/ml，50ng/ml，100ng/ml) IGFBP-1處理HCAEC后AKT，p-AKT表達(dá)情況。
　　6.為了研究AKT途徑是否參與了IGFBP-1對(duì)HCAEC的調(diào)控。在給與AKT抑制劑LY294002(10umol/L)和IGFBP-1(50ng/ml)處理HCAEC后，采用Wester

10、n-Blot檢測(cè)HCAEC的AKT、p-AKT表達(dá)水平變化，采用CCK-8法、3H-TdR摻入法、衰老相關(guān)β-gal染色法、AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞雙染檢測(cè)AKT抑制劑LY294002對(duì)IGFBP-1處理的HCAEC的增殖、衰老、凋亡能力的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:第一部分:
　　1.IGFBP-1與年齡以及冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系:本研究共納入受試者112例，根據(jù)年齡分為:中青年組50例（年齡＜60歲），老年

11、組62例（年齡＞60歲）。所有受試者中老年組的IGFBP-1水平明顯高于中青年組(P=0.001)。IGFBP-1水平與年齡呈正相關(guān)(r=0.505，P＜0.001)。所有受試者根據(jù)造影結(jié)果分為冠狀動(dòng)脈狹窄＜50％組:45例，冠狀動(dòng)脈狹窄≥50％組:67例。冠狀動(dòng)脈狹窄≥50％組的IGFBP-1水平高于冠狀動(dòng)脈狹窄＜50％組(P＜0.001);冠狀動(dòng)脈狹窄≥50％組中冠狀動(dòng)脈中重度狹窄組（Syntax評(píng)分≥23分）的IGFBP-1水平明

12、顯高于輕度狹窄組（Syntax評(píng)分≤22分）P＜0.001;冠狀動(dòng)脈多支病變組的IGFBP-1水平明顯高于單支病變組(P=0.002)。IGFBP-1水平與Syntax評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.409，P=0.001);IGFBP-1水平與GRACE評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.452，P＜0.001)
　　2.IGFBP-1預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的價(jià)值:通過logistic回歸分析發(fā)下，IGFBP-1濃度增加，冠狀動(dòng)脈狹窄≥50％發(fā)生的可

13、能性增高。ROC曲線分析顯示IGFBP-1對(duì)冠狀動(dòng)脈狹窄≥50％進(jìn)行預(yù)測(cè)的曲線下面積(AUC)為0.719(P＜0.001)，敏感度:0.448，特異度:0.933; IGFBP-1聯(lián)合HDL對(duì)冠狀動(dòng)脈狹窄≥50％進(jìn)行預(yù)測(cè)的曲線下面積(AUC)為0.865(P＜0.001)，敏感度:0.821，特異度:0.800。
　　第二部分:
　　1.抑制Jagged1對(duì)HCAEC IGFBP-1表達(dá)的影響:HCAEC Jagged1表

14、達(dá)下調(diào)抑制IGFBP-1的mRNA表達(dá)，si-Control組和si-Jagged1組IGFBP-1的RNA表達(dá)RQ值分別為（1.006±0.133 vs0.474±0.029; P=0.002）;HCAEC Jagged1表達(dá)下調(diào)抑制IGFBP-1分泌，si-Control組和si-Jaggedl組上清中IGFBP-1的含量分別為(197.933±20.805pg/mlvs86.933±13.352pg/ml; P=0.001); H

15、CAEC Jagged1表達(dá)下調(diào)抑制細(xì)胞IGFBP-1蛋白合成，weston Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)si-Control組和si-Jagged1組的IGFBP-1/β-actin分別為(0.498±0.060 vs0.330±0.019; P=0.009)。
　　2.IGFBP-1對(duì)HCAEC增殖的影響:IGFBP-1可呈濃度依賴性的刺激HCAEC增殖，以100ng/ml的濃度處理后HCAEC增殖最明顯。當(dāng)IGFBP-1濃度分別為0ng

16、/ml，5ng/ml，50ng/ml，100ng/ml時(shí)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)各組相對(duì)OD值分別為（1.000±0.031 vs1.080±0.015 vs1.219±0.029 vs1.293±0.023; P＜0.001）。用3H-TdR摻入法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組3H-TdR相對(duì)摻入量分別為(1.000±0.027 vs1.089±0.012 vs1.456±0.074 vs1.526±0.046; P＜0.001)。