通絡(luò)方藥防治動脈粥樣硬化的作用機制研究.pdf

1、本研究采用apoE-/-小鼠(apoE-deficient mice)和人心臟微血管內(nèi)皮細胞(human cardiac microvascular endothelial cells，HCMECs)從整體水平和細胞水平上研究TXL抗AS與抑制氧化應激和炎癥反應的關(guān)系。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 通心絡(luò)抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成
　　目的:觀察通心絡(luò)apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑形成的抑

2、制作用。
　　方法:1.C57BL/6小鼠和apoE-/-小鼠分別給予正常飲食和高脂飲食12周，高脂組小鼠分別給予生理鹽水、通心絡(luò)和阿托伐他汀灌胃12周。2.采用超聲和解剖鏡檢查斑塊面積。3.取小鼠血清測定血脂水平。4.應用蘇木精-伊紅染色和油紅染色對小鼠主動脈弓冰凍切片染色，進一步評價斑塊大小。5.免疫組化法檢查小鼠血管內(nèi)皮細胞CD31的表達。
　　結(jié)果:
　　1.通心絡(luò)抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　2.通

3、心絡(luò)可顯著降低小鼠血脂水平。
　　3.通心絡(luò)通過保護血管內(nèi)皮細胞抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　小結(jié):通心絡(luò)通過降低血脂水平及保護血管內(nèi)皮細胞而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　第二部分 通心絡(luò)抑制血管內(nèi)皮細胞氧化應激反應
　　目的:觀察通絡(luò)干預對C16誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化應激的影響。
　　方法:1.用C16誘發(fā)人心臟微血管內(nèi)皮細胞(HCMEC)的氧化應激反應，同時用不同濃度通心絡(luò)進行干預。2.DHE染

4、色檢測各組HCMEC的ROS水平。3.用相應診斷試劑盒分別檢測細胞培養(yǎng)液中MDA、NO、SOD的水平。4.qRT-PCR檢測HCMEC和小鼠主動脈弓組織中HO-1、p22phox、p47phox的mRNA表達水平。5.Western blot檢測HCMEC中HO-1、p22phox、p47phox的蛋白表達水平。6.免疫組織化學法檢測小鼠主動脈弓組織中HO-1、p22phox、p47phox的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　

5、1.通心絡(luò)可以減輕血管內(nèi)皮細胞的氧化應激。
　　2.通心絡(luò)通過誘導SOD表達而降低脂質(zhì)過氧化，從而減輕氧化應激對HCMEC的損傷。
　　3.通心絡(luò)減輕血管內(nèi)皮細胞氧化應激反應可能與抑制NADPH氧化酶的表達有關(guān)。
　　4.通心絡(luò)抗動脈粥樣硬化的作用可能與抑制NADPH氧化酶亞基的表達有關(guān)。
　　小結(jié):通心絡(luò)通過抑制NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox表達而減少活性氧自由基的產(chǎn)生，通過上調(diào)SOD表達，

6、增加活性氧自由基的清除，減少脂質(zhì)過氧化，在多個環(huán)節(jié)上抑制氧化應激反應。
　　第三部分 通心絡(luò)抑制血管炎癥反應的作用和機制
　　目的:觀察通絡(luò)干預對血管炎癥反應的影響并探討其作用機制。
　　方法:1.用不同濃度C16處理HCMEC，同時用不同濃度通心絡(luò)進行干預。2.ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-1β的含量。3.qRT-PCR檢測HCMEC和小鼠主動脈弓組織中NF-κB和eNOS的mRNA表達水平。4.Wes

7、tern blot檢測HCMEC中NF-κB、eNOS蛋白表達水平以及p22phox、p47phox、NF-κB的磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.通心絡(luò)干預抑制C16誘導的HCMEC炎性細胞因子的表達與釋放
　　對HCMEC培養(yǎng)基進行ELISA檢測的結(jié)果顯示，與對照組相比，C16處理HCMEC以濃度依賴性的方式使HCMEC中TNF-α、IL-1β的分泌量顯著增加，說明C16可以誘導血管內(nèi)皮細胞炎癥反應。通心絡(luò)干預組H

8、CMEC分泌的TNF-α、IL-1β比C16處理組明顯減少并呈濃度依賴性，說明通心絡(luò)可以抑制C16誘導的血管內(nèi)皮細胞合成與釋放炎性因子。
　　2.通心絡(luò)干預抑制HCMEC和小鼠動脈粥樣硬化血管中NF-κB和eNOS表達
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，C16處理使HCMEC中NF-κBmRNA表達水平顯著升高，eNOS的mRNA表達水平顯著下降。給予通心絡(luò)干預后，HCMEC中NF-κB mRNA表達水平比C16處理

9、組明顯下降，而eNOS的mRNA表達水平比C16處理組明顯升高，并且通心絡(luò)的干預作用都呈劑量依賴性。同時，Western blot結(jié)果顯示，各組HCMEC中NF-κB和eNOS的蛋白表達變化趨勢與mRNA相一致。
　　為進一步觀察通心絡(luò)在活體水平上對NF-κB和eNOS的影響，對從各組小鼠主動脈弓提取的RNA進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，高脂組小鼠主動脈弓組織中NF-κB的mRNA表達明顯上調(diào)，而通心絡(luò)灌胃組小鼠

10、的NF-κB mRNA表達顯著下降，其NF-κB mRNA水平與阿托伐他汀灌胃組無差別。免疫組化檢測eNOS表達的結(jié)果顯示，與對照組相比，高脂組小鼠主動脈弓組織中eNOS的表達明顯減少，而通心絡(luò)灌胃組小鼠的eNOS表達顯著上調(diào)。以上結(jié)果說明，通心絡(luò)可以通過下調(diào)NF-κB的表達減輕血管炎癥反應，同時通過上調(diào)eNOS表達改善血管內(nèi)皮功能。
　　3.通心絡(luò)干預抑制C16誘導的NF-κB和p47 phox激活
　　Western b

11、lot結(jié)果顯示，與對照組相比，C16處理HCMEC使p22phox、p47phox和NF-κB的磷酸化水平顯著升高，說明C16激活了NADPH氧化酶系統(tǒng)和NF-κB信號通路。在通心絡(luò)干預的HCMEC中，p47phox和NF-κB的磷酸化水平比C16處理組明顯下降，但對p22phox的磷酸化無影響，說明通心絡(luò)可以抑制NADPH氧化酶系統(tǒng)中p47phox的激活和NF-κB信號通路。
　　小結(jié):通心絡(luò)能夠抑制炎性細胞因子的合成與釋放，其

12、作用機制與抑制p47phox和NF-κB信號通路的激活有關(guān)。
　　第四部分 miR-155在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的:觀察miR-155缺失對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響。
　　方法:1.收集冠心病患者血液，用qRT-PCR方法檢測血液中miR-155的水平。2.應用蘇木精-伊紅染色和油紅染色對小鼠主動脈弓冰凍切片進行染色，評價斑塊大小。3.免疫熒光檢測小鼠主動脈弓組織中Mac-2和KLF5的表達水平和共定

13、位情況。
　　結(jié)果:
　　1.冠心病患者血清中miR-155的含量及其與冠心病危險因素的相關(guān)性分析
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常人相比，冠心病患者血液中miR-155的水平明顯下降。經(jīng)多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清中miR-155水平與總膽固醇、糖尿病等心血管危險因素呈明顯負相關(guān)，而與高血壓、吸煙等危險因素無關(guān)。
　　2.miR-155缺失抑制小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成
　　油紅染色結(jié)果顯示

14、，與apoE-/-小鼠相比，miR-155-/-apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊顯著減少，同時miR-155-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊少于apoE和miR-155基因雙敲除小鼠，說明miR-155缺失抑制了小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。蘇木精-伊紅染色的結(jié)果顯示，apoE-/-小鼠血管內(nèi)膜增生及斑塊形成明顯，而miR-155-/-apoE-/-小鼠血管內(nèi)膜增生和斑塊均不明顯，同時miR-155-/-小鼠幾乎觀察不到血管內(nèi)膜增生和斑塊

15、。這些結(jié)果進一步說明miR-155缺失可以抑制血管內(nèi)膜增生及斑塊的形成。
　　3.miR-155缺失抑制巨噬細胞浸潤和KLF5表達
　　為了揭示miR-155在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用，對高脂飲食小鼠主動脈弓進行免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，apoE-/-小鼠血管內(nèi)膜中有大量巨噬細胞浸潤并伴有KLF5表達增加，而miR-155-/apoE-/-小鼠血管內(nèi)膜中巨噬細胞浸潤較少，同時巨噬細胞表達KLF5減少，miR-155-/-小

16、鼠浸潤到血管壁中的巨噬細胞數(shù)量和KLF5表達水平與miR-155-/-apoE-/-小鼠近似。這些結(jié)果說明，miR-155缺失可以抑制巨噬細胞向血管壁中的浸潤，減少KLF5在巨噬細胞中的表達，這可能是miR-155參與血管內(nèi)膜增生及動脈粥樣硬化斑塊形成的機制之一。
　　小結(jié):冠心病患者血液中miR-155的水平明顯低于健康對照者，其與總膽固醇、糖尿病等心血管危險因素呈負相關(guān);miR-155缺失可以抑制血管內(nèi)膜增生和動脈粥樣硬化斑塊

17、的形成，其作用機制可能與抑制巨噬細胞浸潤以及減少KLF5在巨噬細胞中的表達有關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.通心絡(luò)通過降低血脂水平及保護血管內(nèi)皮細胞而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　2.通心絡(luò)通過抑制NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox表達而減少活性氧自由基的產(chǎn)生，通過上調(diào)SOD表達，增加活性氧自由基的清除，減少脂質(zhì)過氧化，在多個環(huán)節(jié)上抑制氧化應激反應。
　　3.通心絡(luò)能夠抑制炎性細胞因子的合成與釋放，