臭氧化油殺精避孕潛能及機(jī)制探討.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述:
　　第一部分:臭氧化油體外殺精實(shí)驗(yàn)
　　目的：通過(guò)觀察不同濃度臭氧化油對(duì)人精子活力的影響，探索其瞬時(shí)制動(dòng)所有接觸精子的最低有效濃度。
　　方法：按照第五版人類精液檢驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室處理手冊(cè)，收集正常精液參數(shù)的人精液標(biāo)本，采用密度梯度離心法對(duì)精液標(biāo)本進(jìn)行優(yōu)化。用不同濃度臭氧化油（3、4、5、6、7μg/mL）100μL按1:1（v/v）與處理優(yōu)化后的精子懸液共同孵育20s，記錄20s后精子活力

2、（PR+NP）％；（PR+NP）%為0組立即洗滌去除臭氧化油后重懸于精子培養(yǎng)液中進(jìn)行精子活力恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，分別在0、5、10、30、60min時(shí)間點(diǎn)觀察去除臭氧化油后精子活力恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：臭氧化油與精子作用20s后，3、4、5、6、7μg/mL臭氧化油處理后精子活力分別為（30.11±4.15）%、（20.11±5.18）%、（7.50±2.96）%、(1.70±1.70)%、0，各實(shí)驗(yàn)組精子活力與橄欖油對(duì)照組[(72.70±

3、2.42)%]與Ham’s F-10對(duì)照組[(77.90±2.10)%]比較均有顯著性降低（P<0.01），橄欖油組與Ham’s F-10對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；6μg/mL濃度臭氧化油組僅可見(jiàn)極少數(shù)精子原地活動(dòng)，臭氧化油制動(dòng)精子的MEC為(5.80±0.25)μg/mL；作用20s后精子活力為0組經(jīng)洗滌去除臭氧化油后不同時(shí)間點(diǎn)觀察至60min活力仍然未見(jiàn)恢復(fù)。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)臭氧化油呈劑量依賴性抑制體

4、外精子活力，其瞬時(shí)（20s）制動(dòng)所有接觸的精子且經(jīng)洗滌觀察60min后活力仍不恢復(fù)的MEC為6μg/mL，提示6μg/mL濃度臭氧化油可能是最為理想的體外殺精子濃度。因此設(shè)定6μg/mL作為本文第二部分研究的有效劑量。
　　第二部分:臭氧化油的體外殺精作用機(jī)制探討
　　目的：觀察臭氧化油(6μg/mL)對(duì)人精子活率、超微結(jié)構(gòu)、功能及DNA完整性的影響，對(duì)其體外殺精作用機(jī)制進(jìn)行初步探究。
　　方法：收集正常精液參數(shù)的精液

5、標(biāo)本，采用密度梯度離心法優(yōu)化精液標(biāo)本，精子懸液分別與Ham’s F-10、橄欖油和臭氧化油(6μg/mL)按1:1（v/v）處理20s后離心洗滌收集精子沉淀。（1）伊紅-苯胺黑染色法檢測(cè)精子活率；（2）醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染法染色，在透射電鏡下觀察精子超微結(jié)構(gòu)的改變；（3）通過(guò)精子線粒體膜電位檢測(cè)評(píng)估線粒體功能；（4）用PSA-FITC和Hoechst33258雙重?zé)晒馊旧z測(cè)鈣離子載體A23187誘發(fā)的活精子的頂體反應(yīng)；（5）通過(guò)精子

6、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析來(lái)評(píng)估精子DNA的完整性。
　　結(jié)果：（1）活率結(jié)果：臭氧化油組精子活率為(31.09±3.30)%，與橄欖油[(87.64±1.01)%]和Ham’sF-10[(89.73±0.84)%]組相比都有顯著降低（P<0.01）；（2）超微結(jié)構(gòu)觀察：Ham’sF-10對(duì)照組精子膜連續(xù)，頂體完整，線粒體排列有序，臭氧化油組精子膜破損不連續(xù)，明顯腫脹，線粒體腫脹、排列紊亂，兩組的軸絲9+2結(jié)構(gòu)都未見(jiàn)明顯破壞；（3）線粒體膜電

7、位改變：臭氧化油、橄欖油和Ham’s F-10組正常線粒體膜電位所占的比例分別為（35.63±7.64）%、（77.5±2.90）%和（86.17±1.25）%，臭氧化油組與Ham’s F-10組和橄欖油組相比，都有顯著性降低（P<0.01）；（4）頂體反應(yīng)結(jié)果：臭氧化油、橄欖油和 Ham’s F-10組鈣離子誘導(dǎo)的活精子頂體反應(yīng)率分別為（19.01±2.92）%、（41.01±5.24）%和（43.83±4.75）%，臭氧化油組與 H

8、am’s F-10和橄欖油組比較，都有統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)差異（P<0.01）；自發(fā)性頂體反應(yīng)率分別是（12.56±1.10）%、（12.84±1.43）%和（11.73±1.92）%，三組未見(jiàn)明顯差異（P>0.05）；（5）DNA完整性結(jié)果：臭氧化油、橄欖油和Ham’sF-10組精子DNA碎片指數(shù)分別為（14.70±2.61）%、（11.01±2.07）%和（7.52±0.77）%，臭氧化油組與 Ham’sF-10組相比差異有顯著性（P<0.01