通過激光拉曼光譜系統(tǒng)無損區(qū)分大鼠原代胰島α、β、δ及pp細胞.pdf

1、目的：可見光與細胞內(nèi)分子作用發(fā)生拉曼散射。通過分析拉曼散射光譜，可獲得細胞的“分子指紋”。將其用于不同種類細胞的辨識、分選是目前單細胞拉曼光譜研究的前沿領域。然而，四類胰島內(nèi)分泌細胞的分離及純化仍是個難題，故本實驗將拉曼光譜技術引入大鼠原代胰島α、β、δ及pp細胞的分離及純化中，探討并比較該方法與傳統(tǒng)方法在區(qū)分四種胰島細胞方面的優(yōu)劣，以期為大鼠原代胰島細胞的純化提供一種新的手段。
　　方法：以Sprague-Dawley大鼠為動物

2、模型，提取原代胰島并消化成胰島細胞混合細胞懸液，種植于細胞定位格子培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)至細胞貼壁穩(wěn)定，收集細胞定位格子培養(yǎng)皿中大鼠胰島細胞的拉曼光譜、坐標及照片，然后分別以胰高血糖素、胰島素、生長抑素及胰多肽作為一抗分批次對細胞爬片進行免疫組化染色，根據(jù)免疫組化結(jié)果結(jié)合培養(yǎng)皿坐標定位確定培養(yǎng)皿中每個胰島細胞的分類，并根據(jù)細胞種類將細胞光譜及細胞直徑等數(shù)據(jù)分為4組，即α細胞組、β細胞組、δ細胞組及pp細胞組。四類細胞拉曼光譜特征峰及面積差異

3、采用單因素方差分析進行統(tǒng)計，采用主成分分析聯(lián)合線性判別分析法對四種胰島細胞拉曼光譜進行分析以計算光譜對胰島細胞的區(qū)分正確率，用線性判別分析法對以細胞大小區(qū)分細胞種類進行統(tǒng)計。此外，采用MTT法及胰島素分泌試驗法比較拉曼光譜采集數(shù)據(jù)后的細胞群體與細胞培養(yǎng)箱中的細胞群體活性的差異，采用吖啶橙/碘化丙啶雙染法比較兩組細胞活性率。
　　結(jié)果：貼壁生長的胰島β細胞面積較其他胰島細胞大，四種細胞之間面積的差異具有統(tǒng)計學意義；然而單純利用面積對

4、四種胰島細胞進行分類，正確區(qū)分率僅為38.3％。四種胰島細胞的拉曼光譜既有共同的特征峰也存在差異顯著的波峰，即二者有不同的“細胞分子指紋”，方差分析結(jié)果顯示在530 cm-1、725 cm-1、785 cm-1、828 cm-1、852 cm-1、893 cm-1、937 cm-1、947 cm-1、1002 cm-1、1053 cm-1、1091 cm-1、1128 cm-1、1209 cm-1、1255 cm-1、1301 cm-1

5、、1342 cm-1、1575 cm-1、1615cm-1以及1665 cm-1處四種細胞波峰強度有顯著差異；且將該特點結(jié)合主成分分析聯(lián)合線性判別分析的方法對胰島α、β、δ及pp細胞進行分類，正確率為98.6%，經(jīng)交叉驗證其正確分類率為93.6%；且細胞活性鑒定實驗表明該實驗條件下細胞活性與培養(yǎng)箱中細胞活性相當，MTT結(jié)果提示實驗組與對照組吸光度A值差異無統(tǒng)計學意義，細胞在高糖刺激下胰島素分泌效率相當，細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義。