基于衰老雌鼠模型探討鐵皮石斛“補腎”功效的科學(xué)內(nèi)涵.pdf

1、傳統(tǒng)中醫(yī)對石斛功效評價很高，《本草通玄》記載石斛“咸能益腎，多功于水土（腎、脾）二臟”;《本草思辨錄》記載石斛為腎藥、為肺藥、為腸胃藥;《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為石斛新鮮或干燥莖入藥，有滋陰清熱、補腎益精之功效;《藥性論》中石斛“主治腰腳軟弱，骨中虛損，補腎積精，養(yǎng)腎氣，益力”;《本草綱目》評價鐵皮石斛“強陰益精，補腎益力，壯筋骨，益智除驚，補五臟虛勞羸瘦，輕身延年”;《道藏》更將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首，因其具有獨特的藥用價值和保健功

2、效，成為歷代養(yǎng)生補品，說明石斛的延緩衰老作用早已被認(rèn)識。
　　近來研究證實mTOR（mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）通路的調(diào)節(jié)作用與機體衰老密切相關(guān)，可通過活化NF-κB、促炎癥因子釋放等而參與炎癥衰老的過程。線粒體功能紊亂致氧自由基生成增加是衰老調(diào)控機制之一，線粒體功能受損及數(shù)量減少與諸多年齡相關(guān)疾病密切聯(lián)系。mTORC1受抑制后可致發(fā)揮保護功能的基因群活化，通過限制線粒體呼吸

3、減少氧自由基造成的損傷，從而致機體壽命延長。我們前期研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛抗雌鼠卵巢衰老的機制可通過增強血液中的抗氧化酶活性、抑制促炎癥因子的釋放、抑制NF-κB炎癥通路的活化來調(diào)控，因此，本研究進一步提出“鐵皮石斛可通過抑制mTOR信號通路過度活化，參與調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，改善生殖衰老，從而影響多種老年疾病的相關(guān)進程，發(fā)揮“補腎、延年益壽”的作用。
　　目的:
　　基于鐵皮石斛“補腎、延年益壽”的功效及結(jié)合“腎主骨生髓

4、、主藏精、主生殖”的中醫(yī)理論，本研究通過構(gòu)建去勢致骨質(zhì)疏松小鼠模型、D-半乳糖致亞急性衰老小鼠及自然衰老小鼠模型，分別探討鐵皮石斛“壯筋骨、益智、強陰益精、補五臟輕身延年”等功效。
　　方法:
　　一、從“腎主骨”的角度探討鐵皮石斛“補腎益力、壯筋骨”的功效
　　昆明小鼠，雌性，1月齡。進行去勢手術(shù)，術(shù)后1個月將造模組小鼠隨機分為:去勢模型組、雌二醇組（0.17 mg/kg）、鐵皮石斛榨汁組（2 g生藥（鮮品）/kg，

5、含多糖約130mg/kg)、鐵皮石斛多糖組(140 mg/kg，含多糖約130mg/kg)，另取同批空白小鼠作為假手術(shù)組，連續(xù)給藥1個月。檢測指標(biāo)包括:(1)血清生化指標(biāo):鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;(2)組織病理檢查:子宮組織;(3)骨組織形態(tài)學(xué)觀察:骨組織計量學(xué)及骨密度考察。
　　二、從“腎生髓”的角度探討鐵皮石斛“益智”的功效
　　昆明小鼠，雌性，1月齡。

6、通過皮下注射1 g/kg D-半乳糖連續(xù)8周建立D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型，造模2周后隨機分為D-半乳糖模型組、雌二醇組(0.17mg/kg)、鐵皮石斛榨汁組(2g生藥(鮮品)/kg，含多糖約130mg/kg）、鐵皮石斛多糖組(140mg/kg，含多糖約130mg/kg)。另取同批空白小鼠作為正常組，連續(xù)給藥3個月。去勢模型采用上一章節(jié)中同樣造模方法進行模型構(gòu)建，術(shù)后6個月進行分組給藥，給藥劑量不變，給藥周期為13個月。檢測指標(biāo)包括

7、:(1)行為學(xué)考察:Morris水迷宮實驗;(2)臟器病理檢查:腦組織。
　　三、從“腎藏精”探討鐵皮石斛“補五臟、延年益壽”的功效
　　采用第三章第二節(jié)D-半乳糖致亞急性雌性衰老模型小鼠;將9月齡衰老動物隨機分為:自然衰老模型組、鐵皮石斛榨汁組(2g生藥(鮮品)/kg，含多糖約130mg/kg)、鐵皮石斛多糖組(140 mg/kg，含多糖約130mg/kg)，連續(xù)給藥至小鼠全部死亡;野生型黑腹果蠅，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院

8、李耿老師饋贈，收集8h內(nèi)羽化的果蠅隨機分為空白對照組、3％紅景天組、雌二醇組、1％鐵皮石斛榨汁組、3％鐵皮石斛榨汁組、9％鐵皮石斛榨汁組、0.1％鐵皮石斛多糖組、0.3％鐵皮石斛多糖組、0.9％鐵皮石斛多糖組。將藥液配于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每5天更換培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)至果蠅全部死亡。檢測指標(biāo)包括:(1)D-半乳糖致亞急性衰老小鼠:體溫變化，臟器病理檢查:心、肝、脾、胸腺、肺、腎、腎上腺，重要臟器線粒體膜電位檢測:腦、脾、胸腺、腎上腺;(2)自然

9、衰老小鼠:體重、體溫變化，壽命觀察;(3)黑腹果蠅:壽命觀察。
　　四、從“腎主生殖”的角度初步探討鐵皮石斛“補腎、強陰益精”功效的作用機制
　　昆明小鼠，雌性，1月齡。D-半乳糖致亞急性衰老模型采用第三章第二節(jié)中同樣造模方法進行模型構(gòu)建，造模兩周后隨機分為:D-半乳糖模型組、雌二醇組(0.17mg/kg)、鐵皮石斛榨汁組（2 g生藥（鮮品）/kg，含多糖約130mg/kg）、鐵皮石斛多糖組(140mg/kg，含多糖約130

10、mg/kg)，另取同批空白小鼠作為正常組，連續(xù)給藥4個月。檢測指標(biāo)包括:(1)臟器病理檢查:子宮及卵巢組織;(2)子宮及卵巢線粒體功能檢測:ATP含量、線粒體膜電位分析及線粒體介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因及線粒體融合蛋白-2基因表達檢測;(3)子宮及卵巢組織mTOR通路相關(guān)基因表達檢測。
　　結(jié)果:
　　一、從“腎主骨”的角度探討鐵皮石斛“補腎益力、壯筋骨”的功效
　　鐵皮石斛能提高血清磷、鈣、堿性磷酸酶含量，對鈣磷平衡具有一定的

11、調(diào)節(jié)作用，并能降低MDA含量，提高SOD活性，對子宮組織、骨小梁骨皮質(zhì)變薄、形態(tài)結(jié)構(gòu)性差等病變程度也具有改善作用，榨汁液更能顯著升高子宮系數(shù)，增加骨小梁面積百分比、骨小梁數(shù)目以及降低骨小梁分離度，多糖亦能不同程度地改善上述骨小梁形態(tài)變化，提示鐵皮石斛能促進骨形成，可能通過增強機體的抗氧化能力，有效改善氧自由基代謝異常，從而起到抗骨質(zhì)疏松作用。
　　二、從“腎生髓”的角度探討鐵皮石斛“益智”的功效
　　D-半乳糖造模8周后，小

12、鼠血清SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，表明機體造成氧化損傷，模型建立成功。去勢老年小鼠與青年組比較，學(xué)習(xí)能力明顯低下，與去勢青年小鼠比較差異不明顯，提示經(jīng)過去勢手術(shù)后會對定位搜索及空間搜索學(xué)習(xí)能力均有一定的影響，進一步說明雌激素缺乏可以導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能減退、加重腦衰老。在D-半乳糖模型中，與模型組相比，榨汁組潛伏期和搜索距離均明顯縮短，且空間探索實驗中的目標(biāo)象限停留時間比及游泳距離比均顯著增加，提示鐵皮石斛對D-半乳糖模型定位航

13、行的學(xué)習(xí)能力有一定增強作用，對空間探索中的記憶鞏固能力作用更為明顯;在去勢模型中，鐵皮石斛榨汁液能縮短去勢初老小鼠搜索距離，對去勢初老模型定位航行中的學(xué)習(xí)能力有一定作用，對去勢老年模型的學(xué)習(xí)記憶能力改善不明顯。提示鐵皮石斛對氧化損傷及激素缺失造成的腦記憶功能障礙有一定改善作用，可能通過清除自由基，改善氧化損傷造成的腦組織神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少及神經(jīng)元纖維纏結(jié)現(xiàn)象，促進受損神經(jīng)元的恢復(fù)，提高腦神經(jīng)元的細(xì)胞活力，改善腦組織和延緩腦的老化，從而激

14、發(fā)和提高腦的智能，使動物的學(xué)習(xí)能力提高。但對激素缺失的老年機體作用不明顯，提示在激素缺乏及年齡增長雙重刺激下所導(dǎo)致的腦記憶功能障礙程度較嚴(yán)重，鐵皮石斛對此改善作用不明顯。
　　三、從“腎藏精”探討鐵皮石斛“補五臟、延年益壽”的功效
　　鐵皮石斛對D-半乳糖致亞急性衰老小鼠局部溫度影響并不明顯，而多糖則對自然衰老小鼠的肩胛部、背部及腹部溫度升高較明顯，表明鐵皮石斛多糖對老年基礎(chǔ)代謝生命活動有一定的增強作用。鐵皮石斛對D-半乳糖

15、致亞急性衰老雌鼠中各重要臟器病變均有不同程度的改善作用，對腦、脾臟及腎上腺組織ATP含量有升高的作用，并能明顯升高腦及脾臟組織線粒體膜電位，改善去極化現(xiàn)象，對臟器的凋亡壞死有一定的保護作用。在自然衰老小鼠模型及黑腹果蠅模型中，鐵皮石斛平均壽命及半數(shù)死亡時間均有一定的延長;且以榨汁組在自然衰老小鼠模型中延長最為明顯。表明鐵皮石斛具有一定補五臟功效及延長壽命的作用。
　　四、從“腎主生殖”的角度初步探討鐵皮石斛“補腎、強陰益精”功效的

16、作用機制
　　鐵皮石斛可升高子宮系數(shù)，改善子宮萎縮現(xiàn)象;臟器病理檢查分析表明能改善子宮、卵巢等病理變化。鐵皮石斛可升高雌性衰老小鼠子宮及卵巢組織ATP含量，通過下調(diào)卵巢組織Mfn2、上調(diào)子宮及卵巢組織Bcl-2、下調(diào)子宮組織Bax基因表達水平，增加Bcl-2/Bax的表達比率，保護線粒體膜并升高線粒體膜電位，緩解D-半乳糖對子宮及卵巢組織線粒體的損傷，抑制子宮及卵巢組織的凋亡從而延緩衰老。鐵皮石斛對卵巢組織mTOR基因表達水平也具

17、有下調(diào)作用，但目前對mTOR信號通路的了解不十分完全且細(xì)胞凋亡機制尚未研究明確，因此鐵皮石斛是否通過抑制mTOR信號通路發(fā)揮抗凋亡保護作用仍需進一步的實驗研究。
　　結(jié)論:
　　本研究以鐵皮石斛為研究對象，采用去勢致骨質(zhì)疏松小鼠模型、D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型、自然衰老小鼠模型及黑腹果蠅模型，從“腎主藏精、主骨、生髓、主生殖”多角度探討鐵皮石斛“強陰益精、壯筋骨、益智、補五臟、輕身延年”等功效，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛可能通過補益腎