孤束核Phox2b神經(jīng)元化學(xué)敏感性的分子機(jī)制研究.pdf

1、中樞呼吸化學(xué)感受器反射通過動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)呼吸運(yùn)動(dòng)和排出CO2維持腦和外周組織的酸堿平衡，因此是一種維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要反射。中樞呼吸化學(xué)感受器實(shí)際上是一個(gè)相互連接、相互作用的神經(jīng)環(huán)路，包括幾個(gè)特定腦干核團(tuán)的神經(jīng)元，例如斜方體后核（retrotrapezoid nucleus，RTN）和孤束核（nucleus tractus solitaries，NTS）等，能感受腦組織細(xì)胞外液的PCO2或局部H+濃度變化而激活。中樞呼吸化學(xué)感受器，最少需要滿足

2、以下幾個(gè)特征：對(duì)生理范圍內(nèi)CO2/H+的變化具有內(nèi)在敏感性；在整體水平能感受CO2刺激并引起適應(yīng)性通氣反應(yīng)；與呼吸節(jié)律中樞有功能上的聯(lián)系，選擇性地激活、抑制或者損毀此細(xì)胞群能易化或者抑制呼吸化學(xué)感受器反射。雖然NTS神經(jīng)元基本上滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，但有些問題尚需進(jìn)一步明確，例如NTS化學(xué)敏感性神經(jīng)元是否有共同的分子標(biāo)識(shí)？這些細(xì)胞上能感受CO2/H+的分子是什么？ Paired-like homeobox2b（Phox2b）是配對(duì)同源盒基因，編

3、碼一種同源盒轉(zhuǎn)錄因子，特異性地表達(dá)在呼吸反射傳入通路的神經(jīng)元上，例如，頸動(dòng)脈體和主動(dòng)脈體、巖狀神經(jīng)節(jié)、結(jié)狀神經(jīng)節(jié)、NTS和RTN等。而且， Phox2b基因突變是先天性中樞性低通氣綜合征（CCHS）的重要致病因素，大多數(shù)CCHS患者的Phox2b（>90％）存在聚丙氨酸的重復(fù)擴(kuò)張（雜合性突變），可能導(dǎo)致中樞化學(xué)感受器的結(jié)構(gòu)性缺陷及功能紊亂。研究表明，幾乎所有RTN的Phox2b神經(jīng)元都具有化學(xué)敏感性，激活后參與呼吸調(diào)控，提示Phox2b

4、可能是中樞化學(xué)感受器的一種重要的分子標(biāo)識(shí)，但是NTS的Phox2b神經(jīng)元是否具有化學(xué)敏感性及其離子機(jī)制尚待明確。本課題正是基于上述領(lǐng)域存在的科學(xué)問題而設(shè)計(jì)，具體內(nèi)容如下：
　　目的：本研究旨在應(yīng)用電生理、單細(xì)胞RT-PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)，在Phox2b-EGFP-Jx101轉(zhuǎn)基因小鼠的NTS區(qū)，觀察Phox2b神經(jīng)元對(duì)CO2/H+的電生理反應(yīng)；CO2/H+敏感性神經(jīng)元的生物化學(xué)表型的分析。
　　方法：⑴Phox2b-EG

5、FP-Jx101轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定：應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行基因型鑒定；免疫熒光技術(shù)測試綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）標(biāo)記的神經(jīng)元是否為Phox2b免疫反應(yīng)陽性。⑵在急性制備的小鼠腦片上，應(yīng)用細(xì)胞貼附式和全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察CO2/H+對(duì)Phox2b神經(jīng)元自發(fā)放電頻率、細(xì)胞膜電位和全細(xì)胞電流的影響。⑶應(yīng)用單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)對(duì)具有化學(xué)敏感性Phox2b神經(jīng)元進(jìn)行生物化學(xué)表型分

6、析。
　　結(jié)果：①免疫熒光結(jié)果表明，100%EGFP表達(dá)的NTS神經(jīng)元為Phox2b免疫反應(yīng)陽性。②在阻斷突觸傳遞條件下，Phox2b神經(jīng)元的一個(gè)亞群（43%）表現(xiàn)為對(duì)CO2/H+的敏感性反應(yīng)，這些神經(jīng)元主要分布在NTS的中央亞核和背側(cè)亞核。③細(xì)胞貼附式膜片鉗記錄表明，降低灌流液pH值或高碳酸溶液均使Phox2b神經(jīng)元自發(fā)放電頻率增加；因酸化使放電頻率變化表現(xiàn)為持續(xù)性或瞬時(shí)性增加兩種模式。④全細(xì)胞電流鉗模式下，降低灌流液pH值使P

7、hox2b神經(jīng)元膜電位去極化，放電頻率增加；全細(xì)胞電壓鉗模式記錄到一種pH敏感性電流，反轉(zhuǎn)電位大約是-85mV，推測為一種背景鉀離子電流。⑤單細(xì)胞RT-PCR結(jié)果揭示，具有化學(xué)敏感性的Phox2b神經(jīng)元均表達(dá)2型囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（vesicle glutamate transporter2，VGlut2），90%表達(dá)4型G蛋白耦聯(lián)受體（G protein coupled receptor4，GPR4）。
　　結(jié)論：孤束核Phox2