miR-122a對肝癌細胞放療敏感性的影響及分子機制研究.pdf

1、背景和目的
　　 原發(fā)性肝細胞癌(HCC，hepatocellular carcinoma)是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，我國是受肝癌威脅最大的國家，發(fā)病率和死亡率約占全球的50%[1]。大量研究表明，肝癌屬于放射中度敏感的腫瘤，其敏感性相當于低分化鱗癌。近年隨著三維適形放療等技術的發(fā)展，逐漸克服了肝臟放射耐受量低的障礙，放療在肝癌治療中的作用也日益受到重視和肯定[2]。但肝癌放療療效遠不盡人意，如何增加放射敏感性、有效

2、提高肝癌放療療效仍是目前亟待解決的熱點問題。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約為19～25個核苷酸(nt)、非編碼的單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結構、長約70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經Dicer酶加工后生成[3-4]，廣泛分布在病毒、植物、高等哺乳動物中。通過與一種或多種mRNA部分序列堿基互補而在翻譯水平上調節(jié)這些靶基因的表達[5]。近年多項研究證實，miRNAs表達失調與

3、多種腫瘤相關，并且miRNAs具有腫瘤抑制基因或癌基因的功能[6-9]。不同的腫瘤具有不同miRNAs表達特征譜[10-16]，有研究表明miRNAs的差異表達與腫瘤放療敏感性密切相關[17-20]，但目前對miRNA的具體作用機制認識有限，如具體分子機制能得以闡明，miRNAs聯合放療將成為一種非常具有潛力和臨床應用價值的治療手段。
　　 miR-122a定位于人染色體的18q21.31，是肝臟特異性高表達miRNA，約占成年

4、個體肝臟總miRNAs的70%[21]，每個肝細胞表達量達66000拷貝以上，參與肝細胞分化、增殖、凋亡等眾多生物學過程，有研究發(fā)現miR-122a在70%肝癌組織和肝癌來源的細胞系中表達下調[22]，并證實miR-122a在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[22-28]。在我們課題組的前期研究中，利用miRNA芯片技術篩選肝癌細胞HepG2和正常肝上皮細胞LO2中miRNAs的差異表達譜，發(fā)現在HepG2細胞中miR-122a呈低表達，

5、并且有研究表明miR-122a表達水平的改變可以使肝癌細胞株對化療藥物的敏感性發(fā)生變化[29]，而miR-122a與肝癌放療的關系國內外尚沒有相關報道。因此本課題主要探索miR-122a的功能及其與肝癌細胞放療敏感性的關系。
　　 研究miRNA作用機制的關鍵是正確認識miRNA及其靶基因的相互作用。我們利用miRNA靶標基因數據庫miRGen3.0[30]對miR-122a的靶基因進行預測，并對其靶基因進行功能富集分析(GO-

6、Analysis)、信號轉導通路富集分析(Pathway-Analysis)和蛋白質相互作用網絡分析，從而為尋找調控肝癌細胞放療敏感性相關的靶基因提供依據。
　　 為了進一步研究miR-122a對肝癌細胞放療敏感性的作用以及分子機制，我們從預測的miR-122a靶基因中篩選出與放射敏感性密切相關的兩個分子cyclin G1和APE1進行分析。cyclin G1是新近發(fā)現的一種細胞周期蛋白，在多種腫瘤中高表達，其基因啟動子內包括兩

7、個p53蛋白的結合位點，是“p53-細胞周期”信號轉導通路的重要效應分子，其主要作用是調控細胞周期G2/M期的轉換，參與了腫瘤的損傷修復，并與腫瘤細胞放療抵抗作用密切相關。目前有文獻報道證實cyclin G1為miR-122a的靶基因，因此，miR-122a也可能通過作用于cyclin G1在調控肝癌細胞放射敏感性中發(fā)揮作用。APE1是DNA堿基切除修復途徑(BER)的關鍵限速酶，主要負責由電離輻射和基因毒性藥物如烷化劑引起的細胞核及線

8、粒體基因組DNA損傷，參與和調節(jié)眾多生物學過程，包括細胞生長和分化、細胞凋亡以及腫瘤放療抵抗性[31]。本課題組前期已經對APE1功能進行了系統的研究，確定APE1在腫瘤放療抵抗中發(fā)揮核心作用[32-33]，因此，驗證miR-122a調控APE1表達是闡明miR-122a參與肝癌細胞放射敏感性作用的重要機制。本課題利用細胞周期分析、MTT、克隆形成分析、細胞凋亡等技術和方法分析miR-122a對肝癌細胞的細胞周期、增殖與凋亡等生物學行為

9、的干預作用，并進一步利用慢病毒轉染、蛋白表達等方法探討miR-122a和cyclin G1、APE1之間的作用及其與p53的關系，初步驗證miR-122a參與調控肝癌細胞放療敏感性的作用及其可能分子機制，為揭示miR-122a在肝癌中韻生物學功能，解決臨床腫瘤患者的放療增敏作用提供理論和實驗依據。
　　 方法：
　　 1.應用不同的生物信息學方法對miR-122a的靶基因進行預測，并對其靶基因進行功能富集分析、信號轉導通

10、路富集分析和蛋白質相互作用網絡分析。
　　 2.應用miR-122a過表達慢病毒載體使不同p53表達狀態(tài)的肝癌細胞株中的miR-122a表達升高。
　　 3.利用細胞周期分析、MTT、克隆形成分析、細胞凋亡等技術和方法分析miR-122a對電離輻射前后的不同p53表達狀態(tài)的肝癌細胞的細胞周期、細胞增殖與凋亡等生物學行為的影響。
　　 4.應用Western blot法分析miR-122a與APE1、cyclin

11、G1蛋白表達的相關性。
　　 5.應用雙熒光素酶報告基因實驗驗證APE1是否為miR-122a的直接作用靶基因。
　　 結果：
　　 1.目前預測miR-122a的靶基因有1104個，其靶基因涉及細胞周期、信號轉導、細胞增殖、分化和細胞凋亡等眾多生物學過程。
　　 2.miR-122a對Hep3B的細胞周期進程有明顯的阻滯作用，而對HepG2細胞周期進程無明顯影響。
　　 3.miR-122a抑制

12、電離輻射后細胞的增殖，促進肝癌細胞的凋亡。
　　 4.肝癌細胞株中miR-122a的表達升高后，Hep3B細胞中的cyclin G1的表達明顯降低，而HepG2細胞中的cyclin G1的表達無明顯變化。
　　 5.肝癌細胞株中miR-122a的表達升高后，APE1在Hep3B、HepG2細胞中的表達無明顯變化。
　　 結論：
　　 1.生物信息學分析發(fā)現miR-122a的靶基因涉及細胞周期、信號轉導、細