Trop2調(diào)控頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性的分子機(jī)制研究.pdf

1、頭頸鱗癌的早期轉(zhuǎn)移及對(duì)化療藥物不敏感一直是影響患者療效的重要原因，因此尋找頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移和化療增敏有關(guān)的關(guān)鍵分子及其分子機(jī)制一直是人們研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。本文將分章討論一新穎分子-腫瘤相關(guān)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子2(Trop2)對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及其對(duì)化療敏感性的作用及其調(diào)控的分子機(jī)制。
　　 第一章 Trop2在頭頸鱗癌中的異常表達(dá)及其臨床意義
　　 目的：分別在RNA水平和蛋白水平探討頭頸鱗癌組織中Trop2的表達(dá)與腫瘤T分期

2、、臨床分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，并檢測(cè)。Trop2在頭頸鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。
　　 方法：采用熒光定量PCR方法檢測(cè)53例頭頸鱗癌組織、25例癌旁組織的新鮮標(biāo)本；采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)87例頭頸鱗癌組織、20例癌旁組織的石蠟組織標(biāo)本，分析其在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系。采用Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Trop2在頭頸鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)。SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分

3、析。
　　 結(jié)果：
　　 1)Trop2 mRNA在頭頸鱗癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織中的表達(dá)量(P<0.001)，Trop2 mRNA的過表達(dá)表達(dá)與頭頸腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)(P<0.001)，而與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　 2)Trop2蛋白在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌旁粘膜組織(P<0.01)，Trop2蛋白的過表達(dá)與頭頸腫瘤的臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等

4、因素相關(guān)(P<0.01)，而與患者年齡無關(guān)(P>0.05)。
　　 3)Trop2蛋白在頭頸鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)量由高到低依次為Tu686>M4>M2>Hep2>Tu212。
　　 結(jié)論：以上結(jié)果提示檢測(cè)Trop2的表達(dá)與頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，為頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移和化療增敏機(jī)制的研究提供了新的線索。
　　 第二章構(gòu)建沉默Trop2的shRNA的質(zhì)粒載體和建立Trop2-shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株

5、>　　 目的：利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建針對(duì)Trop2基因的shRNA質(zhì)粒載體Trop2-shRNA，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA的細(xì)胞株。
　　 方法：使用pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/RNAi載體構(gòu)建表達(dá)shRNA對(duì)Trop2基因的RNA干擾的質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的Trop2-shRNA及對(duì)照no-targe-shRNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染高表達(dá)Trop2的M4和Tu686細(xì)胞，通過熒光定量PCR、W

6、estern blot及CCK-8法檢測(cè)效果。篩選出有效質(zhì)粒后，應(yīng)用G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建立穩(wěn)定沉默Trop2基因的M4和Tu686細(xì)胞株。
　　 結(jié)果：
　　 1)經(jīng)過質(zhì)粒DNA測(cè)序，pGCsilencerTM H1/Neo/GFP/RNAi(1、2、3號(hào))構(gòu)建成功。
　　 2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后檢測(cè)顯示TACSTD2-RNAi-3質(zhì)粒為RNA干擾效果最強(qiáng)的質(zhì)粒。其在Tu686與M4細(xì)胞Trop2 mRNA沉默效率分

7、別為56.4％和52.7％，在Tu686與M4細(xì)胞Trop2蛋白沉默率分別為49.7％和45.0％。該質(zhì)粒對(duì)Tu686與M4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為27.84±4.15％和25.08±3.73％。
　　 3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TACSTD2-RNAi-3質(zhì)粒后，在Tu686與M4細(xì)胞Trop2 mRNA沉默效率分別為81.5％和76.2％，Trop2蛋白沉默率分別為75.7％和72.8％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了沉默Trop2的sh

8、RNA的質(zhì)粒載體和建立Trop2-shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Tu686與M4細(xì)胞株，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章沉默Trop2基因?qū)︻^頸鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及可能機(jī)制的探討
　　 目的：探討沉默Trop2基因后，頭頸腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)基因表達(dá)的改變
　　 方法：CCK-8法檢測(cè)沉默Trop2基因后對(duì)Tu686細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)與細(xì)胞劃痕

9、試驗(yàn)分別檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA質(zhì)粒的Tu686細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞。Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中E-Cadherin與β-catanin表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA質(zhì)粒的Tu686細(xì)胞在24、48、72小時(shí)的細(xì)胞抑制率明顯高于對(duì)照組，分別為14.3±2.1％，28.7±3.6％、35.4±3.4％，對(duì)照組細(xì)胞在24、48、72小時(shí)的抑制率分別為3.3±1

10、.4％、5.7±1.3％、4.8±1.1％(P<0.001)。
　　 2)細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示Trop2-shRNA Tu686細(xì)胞在48小時(shí)遷移細(xì)胞數(shù)為39±7.7，明顯低于對(duì)照組no-target-shRNA Tu686細(xì)胞68±17.4，細(xì)胞遷移降低率為42.6％(P<0.01)。
　　 3)Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示Trop2-shRNA Tu686細(xì)胞侵襲數(shù)為153±20.6，明顯低于對(duì)照組no-targe

11、t-shRNA Tu686細(xì)胞侵襲數(shù)247±36.4，侵襲能力降低為38.1％(P<0.01)。
　　 4)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)沉默Trop2基因后能同時(shí)增強(qiáng)E-Cadherin的表達(dá)，然而，β=catenin的表達(dá)無明顯改變。
　　 結(jié)論：沉默Trop2的表達(dá)能減弱頭頸鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，Trop2可能對(duì)EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin的表達(dá)起到了調(diào)控作用。4
　　 第四章沉默Tro

12、p2基因?qū)︻^頸鱗癌細(xì)胞化療敏感性的影響
　　 目的：探討沉默Trop2基因后，頭頸鱗癌細(xì)胞化療敏感性的改變
　　 方法：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Trop2-shRNA質(zhì)粒的Tu686和M4細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞均予以不同濃度梯度的紫杉醇或順鉑處理48小時(shí)后，使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。使用IC30的藥物濃度處理Tu686和M4細(xì)胞，24小時(shí)后，使用Tunnel法和AnnexinⅤ法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：
　　

13、 1)紫杉醇作用后Trop2-shRNA tu686細(xì)胞的細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組 no-target-shRNA tu686細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組IC50值(9.931±0.876)×10-8明顯低于對(duì)照組的IC50值(9.484±0.744)×10-7(P<0.001)。
　　 2)紫杉醇作用后Trop2-shRNA M4細(xì)胞的細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組no-target-shRNA M4細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組IC50值(1.959±0.017

14、6)×10-7明顯低于對(duì)照組的IC50值(1.396±0.174)×10-6(P<0.001)。
　　 3)順鉑作用后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組tu686細(xì)胞及M4細(xì)胞的細(xì)胞存活率無明顯差異。(P>0.05)。
　　 4)紫杉醇作用后，Tunnel檢測(cè)法顯示Trop2-shRNA tu686細(xì)胞凋亡比例為44.3±3.4％，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞凋亡比例28.7±2.6％(P<0.01)。AnnexinⅤ流式細(xì)胞檢測(cè)法顯示Trop2-

15、shRNAtu686細(xì)胞凋亡比例為31.39±2.83％，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞凋亡比例14.67±2.77％(P<0.01)。
　　 5)紫杉醇作用后，Tunnel檢測(cè)法顯示Trop2-shRNA M4細(xì)胞凋亡比例為42.8±4.6％，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞凋亡比例27.9±3.1％(P<0.01)。AnnexinⅤ流式細(xì)胞檢測(cè)法顯示Trop2-shRNAM4細(xì)胞凋亡比例為33.75±3.47％，明顯高于對(duì)照組細(xì)胞凋亡比例14.72±