青島文昌魚銅藍(lán)蛋白基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控與肝臟的起源.pdf

1、銅藍(lán)蛋白是一種含銅的α-糖蛋白，廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物體內(nèi)。在肝臟中，新合成的銅藍(lán)蛋白前體在分泌的早期與銅相結(jié)合，伴隨著多糖的修飾形成銅藍(lán)蛋白，進一步釋放到血液中。銅藍(lán)蛋白最突出的功能是:(1)結(jié)合血清中的銅（血液中95％的銅與銅藍(lán)蛋白結(jié)合）和(2)通過自身的亞鐵氧化酶活性抑制鐵離子產(chǎn)生自由基，此外，銅藍(lán)蛋白在胚胎及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、新生毛細(xì)血管的形成、自由基的清除等過程中發(fā)揮重要作用。
　　銅藍(lán)蛋白是多銅氧化酶家族的重要成

2、員。多銅氧化酶家族是極少數(shù)能氧化底物并將氧分子氧化為兩個水分子的一類酶。目前已確認(rèn)的多銅氧化酶有三類分別為:銅藍(lán)蛋白、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白和胎盤鐵轉(zhuǎn)運蛋白。該家族具有亞鐵氧化酶活性，對鐵具有高度的親和性，能夠有效的將Fe2+氧化為Fe3+，在機體內(nèi)的鐵代謝方面具有重要意義。銅藍(lán)蛋白通過抑制Fe2+參與Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)生成的自由基，減少Fe2+積累所導(dǎo)致的毒性。因此銅藍(lán)蛋白對體內(nèi)鐵代謝以及和體內(nèi)鐵濃度的調(diào)節(jié)具有十分重要的作

3、用。
　　頭索動物文昌魚，處于脊索動物門的基部，占據(jù)了無脊椎動物進化到脊椎動物的重要節(jié)點。文昌魚成為了研究脊椎動物起源與進化的重要的模式生物。過去的眾多研究表明，在文昌魚中存在類似于脊椎動物肝臟的組織，被稱為肝盲囊。在脊椎動物中肝臟是銅藍(lán)蛋白合成的重要器官，同時在鐵的貯存和解毒方面發(fā)揮著重要作用，銅藍(lán)蛋白在細(xì)胞內(nèi)鐵的代謝和降低Fe2+毒性方面具有重要作用。雖然銅藍(lán)蛋白廣泛分布于無脊椎動物和脊椎動物中，但目前大量的研究針對的僅是脊椎

4、動物中的銅藍(lán)蛋白，在無脊椎動物當(dāng)中有關(guān)銅藍(lán)蛋白的表達(dá)和調(diào)控的研究則比較有限。
　　在本實驗中，首先對文昌魚中銅藍(lán)蛋白的進行了鑒定、進化分析與組織表達(dá)研究。文昌魚銅藍(lán)蛋白的cDNA的開放閱讀框(ORF)是3534 bp，開放閱讀框編碼1178個氨基酸的蛋白質(zhì)，成熟蛋白的分子質(zhì)量約為130.85 kDa，等電點(PI)為4.83。該蛋白質(zhì)屬于多銅氧化酶家族，具有該家族特有的Cu-oxidase結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過序列比對發(fā)現(xiàn)此預(yù)測的蛋白序

5、列與脊椎動物的銅藍(lán)蛋白具有42.7％到46.1％的相似性，與無脊椎動物有20.7％到49.7％的相似性。雖然文昌魚的序列與人的序列相似性只有45.8％，但是它們的3D結(jié)構(gòu)卻具有驚人的相似性，這說明了文昌魚銅藍(lán)蛋白與人的功能可能也具有一定的相似性。我們通過實時熒光定量聚合酶反應(yīng)檢測到它在文昌魚各個組織中均有表達(dá)，在肝盲囊表達(dá)量最高，具有組織特異性表達(dá)的特點。此外，在文昌魚經(jīng)過鐵離子或脂多糖處理后，銅藍(lán)蛋白的表達(dá)量均會有不同程度的上調(diào)。這些