青島文昌魚(yú)Antithrombin基因的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、凝血是一個(gè)由多種蛋白質(zhì)因子參與的復(fù)雜的級(jí)聯(lián)過(guò)程。在哺乳動(dòng)物中，與凝血相關(guān)的因子都是高度保守的。除此之外，在兩棲類，爬行類，魚(yú)類和鳥(niǎo)類中也發(fā)現(xiàn)了類似功能的凝血系統(tǒng)的相關(guān)因子。最近研究表明無(wú)頜類七鰓鰻中含有類似、脊椎動(dòng)物的凝血因子，但是在尾索動(dòng)物海鞘中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的凝血因子存在。文昌魚(yú)(amphioxus)是介于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物之間的過(guò)渡類型，是現(xiàn)存的與脊椎動(dòng)物祖先最接近的原索動(dòng)物，是研究脊椎動(dòng)物起源和進(jìn)化的重要模式動(dòng)物。研究文昌魚(yú)體

2、內(nèi)是否存在凝血系統(tǒng)的相關(guān)因子對(duì)于探索凝血系統(tǒng)的起源與進(jìn)化有著重要的意義。 抗凝血酶(antithrombin)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(serpin)的成員之一，是凝血系統(tǒng)中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，作為凝血酶的主要抑制劑在血液凝集過(guò)程中維持著凝血與抗凝的平衡。 本文克隆了青島文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)的抗凝血酶基因，命名為BbAT，并對(duì)它的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究

3、。 首先，利用兼并引物PCR和RACE技術(shù)克隆得到了具有完整編碼框的文昌魚(yú)的抗凝血酶基因(BbAT)，并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行分析。該cDNA的閱讀框編碼338個(gè)氨基酸，在1-336個(gè)氨基酸殘基之間包含一個(gè)完整的serpin結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它屬于serpin超家族的C分支(antithrombin)，但是與B分支(較古老的一類serpin)也有一定的同源性。進(jìn)一步將BbAT和其他物種的anti

4、thrombin比較，發(fā)現(xiàn)此蛋白分別和爪蟾，鴕鳥(niǎo)，和人的antithrombin同源性較高，大約有40％的同源性。對(duì)BbAT的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明：其3個(gè)β-折疊和7個(gè)α-螺旋的結(jié)構(gòu)與人的類似，尤其是它的反應(yīng)中心環(huán)(RCL)在氨基酸組成上與脊椎動(dòng)物的具有高度的相似性，這表明BbAT的功能很可能與脊椎動(dòng)物的類似。 哺乳動(dòng)物的肝臟是antithrombin基因的主要合成器官，其他臟器如肺、脾、腎、心、腸、腦等也有少量合成。長(zhǎng)期以來(lái)，文昌魚(yú)

5、的肝盲囊一直被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物肝臟的前體。利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)BbAT在mRNA水平上在成體文昌魚(yú)中的組織表達(dá)模式，結(jié)果表明BbAT基因在肝盲囊表達(dá)量較高，在卵巢、后腸、腮也有表達(dá)，而在精巢、肌肉、神經(jīng)管和脊索沒(méi)有雜交信號(hào)?？梢?jiàn)，與哺乳動(dòng)物類似，BbAT基因在成體文昌魚(yú)組織中呈組織特異性表達(dá)。 為了了解文昌魚(yú)的BbAT是否與脊椎動(dòng)物的一樣具有抑制凝血酶的功能。本文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了BbAT的重組蛋白，命名為rBbAT

6、。并用原核表達(dá)的重組蛋白制備了多克隆抗體，分別用發(fā)色底物法和Western blot的方法驗(yàn)證了rBbAT的蛋白功。利用發(fā)色底物試劑盒，根據(jù)以人的標(biāo)準(zhǔn)血漿為標(biāo)準(zhǔn)品制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出rBbAT抑制凝血酶的活力呈濃度依賴性，且肝素對(duì)它的抑制活力有一定的促進(jìn)作用。另外rBbAT可以與凝血酶形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，且體內(nèi)也存在著的天然BbAT也有類似功能。 綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為：文昌魚(yú)體內(nèi)存在著一類antithrombin，且其功能