大鼠聽(tīng)覺(jué)剝奪后BcL-2、Bax、Fas在聽(tīng)皮層的表達(dá)變化及腦苷肌肽注射液對(duì)其變化的影響.pdf

1、目的:通過(guò)雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)建立聽(tīng)覺(jué)剝奪（Auditory Deprivation，AD）動(dòng)物模型，研究SD大鼠在聽(tīng)覺(jué)剝奪后Bcl-2、Bax、Fas在聽(tīng)皮層的表達(dá)，以及腦苷肌肽注射液對(duì)Bcl-2、Bax、Fas表達(dá)變化的影響，了解聽(tīng)覺(jué)剝奪后聽(tīng)覺(jué)中樞可塑性變化以及腦苷肌肽注射液的作用，為聽(tīng)力障礙患者的輔助治療提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料。
　　方法:
　　1、選擇耳廓反射靈敏、無(wú)中耳疾患、生后3周齡的雄性清潔級(jí)健康SD大鼠，共64只，將其至

2、于適宜的溫、濕度環(huán)境中飼養(yǎng)。按體重將其隨機(jī)分為8組（8只/組）:7天對(duì)照組，7天手術(shù)組，14天對(duì)照組，14天手術(shù)組，14天治療組，28天對(duì)照組，28天手術(shù)組，28天治療組。手術(shù)組大鼠實(shí)施雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)，對(duì)照組大鼠只做耳后切口，治療組大鼠實(shí)施雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)并每日腹腔注射腦苷肌肽注射液，劑量1 ml/kg，連續(xù)14或28天。
　　2、術(shù)后7天對(duì)各組大鼠進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試，然后在相同條件下飼養(yǎng)各組動(dòng)物至對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)后，每組隨

3、機(jī)取4只大鼠的雙側(cè)大腦聽(tīng)皮層做HE染色和免疫組化檢測(cè)，其余4只取聽(tīng)皮層做實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)。
　　3、用HE染色的方法觀察大鼠聽(tīng)皮層部位形態(tài)學(xué)變化。
　　4、采用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠聽(tīng)皮層部位Bcl-2、Bax、Fas的表達(dá)，然后在光鏡下對(duì)棕色顆粒陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　5、采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)大鼠聽(tīng)皮層部位Bcl-2、Bax、Fas基因mRNA的表達(dá)。
　　6、采用Western

4、Blot技術(shù)檢測(cè)大鼠聽(tīng)皮層部位Bcl-2、Bax、Fas蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、ABR測(cè)試情況:對(duì)照組SD大鼠經(jīng)ABR測(cè)試在40SPL dB時(shí)出現(xiàn)重復(fù)波形，耳蝸損毀手術(shù)大鼠術(shù)后7天雙耳在90 SPL dB均不能引出重復(fù)波形，證明聽(tīng)覺(jué)剝奪動(dòng)物模型制作成功。
　　2、術(shù)后一般情況:術(shù)后第二天聽(tīng)覺(jué)剝奪大鼠即能自主飲水?dāng)z食，爬行沿直線，拎尾懸空能保持平衡，但是與對(duì)照組相比行動(dòng)仍顯遲緩。聽(tīng)覺(jué)剝奪大鼠對(duì)外界聲音刺激不

5、敏感，耳廓反射消失，而對(duì)照組耳廓反應(yīng)靈敏。
　　3、HE染色結(jié)果:手術(shù)組和治療組均出現(xiàn)不等量的凋亡細(xì)胞，體積縮小，顏色深染，胞漿著色淺淡，核固縮，染色質(zhì)凝集斷裂，核仁消失。治療組與相應(yīng)的手術(shù)組相比，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減輕，胞漿紅染程度減輕，細(xì)胞核，染色質(zhì)聚集減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠在聽(tīng)覺(jué)剝奪后聽(tīng)皮層出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，腦苷肌肽注射液可以減輕凋亡的程度。
　　4、免疫組化結(jié)果:各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有Bcl-2、Bax、Fas陽(yáng)性細(xì)胞。手術(shù)組Bc

6、l-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于相應(yīng)的對(duì)照組，治療組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于相應(yīng)的手術(shù)組。而手術(shù)組Bax和Fas陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組，治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于相應(yīng)的手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聽(tīng)覺(jué)剝奪后大鼠聽(tīng)皮層表達(dá)促凋亡基因Bax和Fas的細(xì)胞增多，表達(dá)抑凋亡基因Bcl-2的細(xì)胞減少，而腦苷肌肽注射液可以阻止這些變化。
　　5、蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果:手術(shù)組Bcl-2蛋白灰度比值顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組，治療組灰度比值顯著高于相應(yīng)的手術(shù)

7、組。而手術(shù)組Bax、Fas蛋白灰度比值顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組，治療組灰度比值顯著低于相應(yīng)的手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聽(tīng)覺(jué)剝奪后大鼠聽(tīng)皮層促凋亡基因蛋白Bax和Fas表達(dá)升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，而腦苷肌肽注射液可以減輕這些變化的程度。
　　6、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果:手術(shù)組Bcl-2基因mRNA的表達(dá)顯著低于相應(yīng)的對(duì)照組，治療組基因表達(dá)比相應(yīng)的手術(shù)組顯著增強(qiáng)。而手術(shù)組Bax和Fas基因mRNA的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組，治療組基因

8、表達(dá)與相應(yīng)的手術(shù)組比較顯著減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聽(tīng)覺(jué)剝奪后大鼠聽(tīng)皮層促凋亡基因Bax和Fas的表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)減弱，而腦苷肌肽注射液可以阻止這些變化。
　　結(jié)論:
　　1、雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)能夠建立穩(wěn)定性強(qiáng)的聽(tīng)覺(jué)剝奪動(dòng)物模型。
　　2、 Bcl-2、Bax、Fas這三個(gè)基因在大鼠的聽(tīng)皮層均有表達(dá)。
　　3、Bcl-2、Bax、Fas參與了聽(tīng)覺(jué)剝奪后聽(tīng)皮層神經(jīng)元凋亡的過(guò)程。
　　4、腦苷肌肽注射液