Mdx小鼠骨骼肌中炎癥反應(yīng)和mpeg1的表達(dá).pdf

1、目的:進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良(progressive muscular dystrophy，PMD)是一組以進(jìn)行性加重的肌無(wú)力、肌萎縮為主要臨床表現(xiàn)的遺傳性骨骼肌疾病的總稱。由于患者編碼肌細(xì)胞相關(guān)蛋白的基因變異，造成蛋白缺陷或功能障礙，導(dǎo)致肌細(xì)胞的完整性遭到破壞，其中Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)在各類(lèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良中發(fā)病率最高，約為1/3500男嬰，且無(wú)地域和種族間明顯差異。DMD是

2、一種X連鎖隱性遺傳性疾病，其致病基因位于X染色體的Xp21區(qū)，為編碼dystrophin蛋白的基因發(fā)生缺失、插入和點(diǎn)突變，dystrophin蛋白的功能缺失引起肌纖維的變性和壞死。女性多為致病基因攜帶者，發(fā)病者罕見(jiàn)，且癥狀較輕。DMD發(fā)病年齡偏小，起病隱襲，且病死率高，受到廣泛關(guān)注。
　　目前關(guān)于DMD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，涉及到很多常見(jiàn)的機(jī)制，例如鈣離子內(nèi)流，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促炎和促進(jìn)纖維化細(xì)胞因子的激活，各種蛋白水解酶的活化，自噬

3、的缺陷和細(xì)胞凋亡等。研究顯示局部的炎癥反應(yīng)是肌肉纖維化和脂肪組織滲透的觸發(fā)點(diǎn)，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞纖維化并由脂肪組織替代，失去功能。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)起著關(guān)鍵作用，如激活的巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生NO來(lái)裂解肌細(xì)胞，同時(shí)作為主要的促炎因子，通過(guò)激活蛋白水解酶系統(tǒng)和抑制肌肉再生引起肌肉萎縮等。
　　巨噬細(xì)胞表達(dá)基因1(Macrophage expressed gene1，mpeg1)是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于人類(lèi)和鼠科動(dòng)物巨噬細(xì)胞內(nèi)的基因。先前的實(shí)

4、驗(yàn)顯示在斑馬魚(yú)中轉(zhuǎn)入mpeg1基因后巨噬細(xì)胞系反應(yīng)明顯增加，這就使得嗜中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞得以分別被研究，說(shuō)明mpeg1特異性表達(dá)于巨噬細(xì)胞內(nèi)。
　　C57BL/10ScSnDmd mdx/JNju小鼠(X-linked muscular dystrophymouse，X-連鎖肌萎縮小鼠，簡(jiǎn)稱mdx小鼠)為編碼dystrophin蛋白的3185位基因自發(fā)突變，使該位點(diǎn)編碼谷氨酰胺的密碼子變成了終止密碼子，導(dǎo)致基因的表達(dá)提前終止，造

5、成其編碼的蛋白縮短。該模型鼠與DMD患者有相同的遺傳基礎(chǔ)，已經(jīng)被廣泛用于DMD研究的各個(gè)領(lǐng)域。
　　本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)組織化學(xué)染色方法觀察mdx小鼠不同骨骼肌的病理改變，利用基因芯片技術(shù)篩選與炎癥相關(guān)基因在疾病不同時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)觀察mpeg1在mdx小鼠及對(duì)照鼠中的表達(dá)。探討巨噬細(xì)胞相關(guān)性炎癥在mdx小鼠中的作用，進(jìn)而通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)性炎癥反應(yīng)來(lái)改善肌肉質(zhì)量，為DMD提供新的治療靶點(diǎn)。

6、
　　方法:選取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠（購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所）為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為雄性C57BL/6ScSn小鼠，根據(jù)年齡分為2w、4w、8w、12w。每組各時(shí)間點(diǎn)選取6只，3只用于常規(guī)組織化學(xué)染色，3只用于基因芯片檢測(cè)和qRT-PCR測(cè)定。以10％水合氯醛(350mg/Kg體重)腹腔注射麻醉，取小鼠股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌、肱二頭肌、心肌，進(jìn)行包埋冰凍處理。設(shè)置切片厚度為8um，做連續(xù)切片。

7、分別對(duì)冰凍切片行常規(guī)染色，包括HE染色、MGT染色、ACP染色觀察其光鏡下的形態(tài)學(xué)變化，總結(jié)mdx小鼠骨骼肌炎性病理變化;小鼠麻醉后，取小鼠股四頭肌迅速投入液氮冷凍，之后保存于-80℃冰箱，用于mRNA提取，基因芯片的檢測(cè)及mpeg1的qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)用spss13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1、利用常規(guī)組織化學(xué)方法，我們觀察到2w的mdx小鼠股四頭肌、腓腸肌、脛骨前肌和肱二頭肌中肌細(xì)胞大小基本一致，偶見(jiàn)

8、高度濃染的肌纖維，未見(jiàn)肌細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);4w可見(jiàn)巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象散在分布，偶見(jiàn)小灶樣分布;8w時(shí)炎細(xì)胞浸潤(rùn)灶融合成片，12w時(shí)炎性病灶面積減小;mdx小鼠心肌中未見(jiàn)到變性、壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn);同齡對(duì)照鼠各骨骼肌中未見(jiàn)上述病理改變;
　　2、利用基因芯片技術(shù)對(duì)mdx小鼠股四頭肌進(jìn)行mRNA測(cè)定，篩選出有關(guān)炎癥反應(yīng)的基因30余個(gè)，結(jié)果顯示與2w相比，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因隨疾病進(jìn)展表達(dá)量增加，在8w時(shí)達(dá)到峰值，12w有所下降，但較2w

9、時(shí)仍有升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　3、利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)mpeg1基因進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示在2w時(shí)，mdx小鼠與對(duì)照鼠之間mpeg1的含量無(wú)差別;從4w開(kāi)始，mdx小鼠中mpeg1的含量逐漸增加，8w時(shí)含量最高，與對(duì)照鼠同周齡間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但mdx小鼠4w、8w、12w之間表達(dá)量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而對(duì)照鼠各周齡間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　結(jié)論:
　　1、炎癥反應(yīng)參與mdx