基于小鼠外感寒濕模型探討外感寒濕傷脾機(jī)制的理論及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　寒邪和濕邪共同致病,即為寒濕之邪。寒、濕之邪為陰邪,最易損傷陽(yáng)氣。從中醫(yī)傳統(tǒng)理論角度探討外感寒濕致病的病因病機(jī)和治療法則對(duì)外感寒濕致病的研究有著重要意義。本研究擬通過建立外感寒濕模型，探討外感寒濕傷脾的致病機(jī)理和散寒祛濕法對(duì)外感寒濕的治療作用。
　　方法：
　　1.理論研究：
　　查閱相關(guān)文獻(xiàn)，歸納總結(jié)寒邪、濕邪的致病特點(diǎn)，探討外感寒濕致病傷脾的致病途徑、病機(jī)和治法。
　　2.實(shí)驗(yàn)研究：

2、　　45只SPF級(jí)昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分為3組：
　?、僬?duì)照組（下稱正常組）：昆明小鼠15只，常規(guī)室溫（15-20℃）喂養(yǎng)。
　?、谕飧泻疂窠M（下稱模型組）：昆明小鼠15只，連續(xù)7天每天中午12：00-16：00將小鼠臵于溫度為（4±0.5）℃、濕度為90％±2的人工氣候箱中飼養(yǎng)4h，其余時(shí)間按常規(guī)室溫飼養(yǎng)。按0.13ml/10g標(biāo)準(zhǔn)每天給予生理鹽水灌胃。
　　③藥物組（下稱治療組）：昆明小鼠15只，

3、連續(xù)7天每天中午12：00-16：00將小鼠臵于溫度為（4±0.5）℃、濕度為90%±2的人工氣候箱中飼養(yǎng)4h，其余時(shí)間按常規(guī)室溫飼養(yǎng)，根據(jù)人與小鼠體表面積換算，按0.13ml/10g體重標(biāo)準(zhǔn)每天給予加減腎著湯灌胃。取血后頸椎脫臼處死存活動(dòng)物。無菌條件下收集小鼠結(jié)腸糞便，留取小鼠小腸組織。觀察小鼠生存狀態(tài)、分析小鼠體重變化、平板計(jì)數(shù)腸道細(xì)菌，采用病理組織學(xué)觀察小腸病理結(jié)構(gòu)改變，采用免疫組織化學(xué)染色觀察小腸AQP-4、PAR-2、MAPK

4、p38蛋白表達(dá)情況，采用Bio-Plex懸液芯片技術(shù)檢測(cè)血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、TNF-α、IFN-γ細(xì)胞因子的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）觀察小腸AQP-4、PAR-2、MAPKp38、NF-kB、MyD88、TLR4蛋白表達(dá)。
　　3.結(jié)果
　　3.1理論探討
　　外感寒濕的致病途徑分析：寒邪、濕邪共同作用人體而致病，寒濕致病的癥狀表現(xiàn),寒濕客表則惡寒,肢厥;

5、阻于經(jīng)絡(luò)則全身關(guān)節(jié)冷痛浮腫,拘急;寒濕直中脾胃,阻滯氣機(jī),則見濡瀉、嘔逆、胸腹痞滿。寒邪客內(nèi),阻滯氣血津液的運(yùn)行可致水濕內(nèi)生,從而使原來單純的寒證變成寒濕證；濕邪阻滯陽(yáng)氣日久,使陽(yáng)氣損傷,以致陽(yáng)氣不足,陽(yáng)虛生內(nèi)寒或素體陽(yáng)虛感受濕邪,亦使單純的濕證,變成寒濕之證。
　　外感寒濕致病的病機(jī)分析：
　　外感寒濕共同作用，寒傷脾陽(yáng)，影響脾主運(yùn)化功能；寒濕之邪進(jìn)一步損傷腎陽(yáng)，腎陽(yáng)不足，則無力溫煦脾陽(yáng)，進(jìn)而加劇寒濕；寒濕之邪進(jìn)一步作用于

6、人體，損傷一身之陽(yáng)，陰陽(yáng)痹阻、營(yíng)衛(wèi)不和、體表陽(yáng)氣不足，溫養(yǎng)氣化失常；寒濕之邪共同作用人體,易使氣機(jī)不暢，影響脾胃氣機(jī)，寒濕之邪郁阻三焦,水道不利。
　　3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　小鼠一般狀態(tài)觀察：正常對(duì)照組小鼠口唇紅潤(rùn)，耳朵、尾巴呈淡粉色，毛發(fā)順滑有光澤，食量正常，體重逐漸增加，反應(yīng)靈敏；模型組毛發(fā)食量減少，體重減輕，疏松粗糙、晦暗無光澤,同時(shí)出現(xiàn)趾(指)關(guān)節(jié)腫大、足背皮膚水腫、破潰、煩躁不安,撕咬打斗,肛周穢濁，大便不成形或稀便

7、，呼吸粗重等外濕侵襲的癥狀，取材前模型組出現(xiàn)了精神萎靡,嗜臥,懶動(dòng)，神疲,關(guān)節(jié)拘急等癥狀。治療組癥狀較模型組有明顯改善，介于正常組和模型組之間。
　　小鼠體重組間比較結(jié)果：入組時(shí)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組小鼠體重組間比較無差異；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組（30.42±1.72）小鼠體重高于模型組（25.64±1.29），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.01。治療組(27.26±1.17)小鼠體重高于模型組（25.64±1.29），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處

8、理，有顯著性差異， P＜0.05。
　　正常組（7.23±0.72）小鼠結(jié)腸段大腸桿菌計(jì)數(shù)低于模型組（8.49±0.71），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05；治療組（7.24±0.36）小鼠大腸桿菌計(jì)數(shù)低于模型組（8.49±0.71），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。正常組（6.23±0.94）小鼠結(jié)腸段乳酸桿菌計(jì)數(shù)高于模型組（4.66±0.41），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。正常組（5.68±0.

9、69）小鼠結(jié)腸段雙歧桿菌計(jì)數(shù)高于模型組（4.99±0.47），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。
　　小鼠小腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果：光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,層次分明,腸黏膜上皮細(xì)胞的輪廓清晰,染色鮮明,排列規(guī)則。模型組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷程度較重,小腸絨毛部分?jǐn)嗔?上皮細(xì)胞腫脹,腸黏膜下層有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組小鼠的腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷程度較模型組輕,小腸絨毛少部分?jǐn)嗔?上皮細(xì)胞腫脹,腸黏膜下層也伴見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

10、。
　　AQP-4、PAR-2、MAPKp38蛋白IOD值結(jié)果：正常組（20.99±2.84）、治療組（17.71±0.77）的小腸AQP-4蛋白的IOD值均明顯高于模型組（14.7±1.48），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.01或P＜0.05。正常組（8.62±1.55）、治療組（13.22±1.19）的小腸PAR-2蛋白的IOD值均明顯低于模型組（16.76±1.21），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.01。正常組（

11、8.62±1.55）、治療組（13.22±1.19）的小腸MAPKp38蛋白的IOD值均明顯低于模型組（16.76±1.21），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.01。
　　小鼠血清細(xì)胞因子結(jié)果：正常組（166.95±85.56）血清IL-4含量高于模型組（70.51±22.48），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異， P＜0.05。正常組（26.11±14.33）血清 IL-6含量低于模型組（69.61±33.13），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有

12、顯著性差異，P＜0.05。正常組（73.23±26.17）血清IL-10含量高于模型組（36.14±22.48），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。正常組（51.43±25.35）、治療組（80.59±34.91）血清IFN-γ含量低于模型組（138.19±58.81），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織AQP-4蛋白的表達(dá)，正常組（0.49±0.14）高于模型組（0.36±0.13），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性

13、差異，P＜0.05。
　　蛋白免疫印跡結(jié)果：小鼠小腸組織PAR-2蛋白的表達(dá)，正常組（0.18±0.13）、治療組（0.45±0.06）低于模型組（0.52±0.24），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織MAPKp38蛋白的表達(dá)，正常組（0.12±0.08）、治療組（0.29±0.15）低于模型組（0.45±0.12），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織NF-kB蛋白的表達(dá)，正常組（0.32

14、±0.11）、治療組（0.35±0.07）低于模型組（0.54±0.11），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織MyD88蛋白的表達(dá)，正常組（0.09±0.08）低于模型組（0.32±0.12），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。小鼠小腸組織TLR4蛋白的表達(dá)，正常組（0.21±0.10）低于模型組（0.44±0.16），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，有顯著性差異，P＜0.05。
　　4.結(jié)論
　　本研究從中醫(yī)理論

15、出發(fā)，結(jié)合寒邪、濕邪的致病特點(diǎn)，分析外感寒濕致病的病機(jī)是外感寒濕直接傷脾陽(yáng)、外感寒濕進(jìn)一步損傷腎陽(yáng)、最終外感寒濕傷一身之陽(yáng)，影響脾主運(yùn)化功能和脾胃氣機(jī)，導(dǎo)致體內(nèi)水液代謝障礙、脾主運(yùn)化功能失常等表現(xiàn)。對(duì)外感寒濕的治療要從散寒祛濕立法。
　　本研究成功建立了外感寒濕模型。模型組小鼠出現(xiàn)體重下降、腸道菌群失調(diào)、小腸炎性反應(yīng)、組織結(jié)構(gòu)紊亂、水液代謝障礙、免疫系統(tǒng)紊亂等多個(gè)方面的改變，符合外感寒濕致病的病理表現(xiàn)。
　　模型組小鼠出現(xiàn)的

16、腸道菌群紊亂、小腸炎性反應(yīng)、組織結(jié)構(gòu)紊亂等變化，可能是外感寒濕損傷脾陽(yáng)，影響脾主運(yùn)化功能的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。模型組小鼠出現(xiàn)的水液代謝異常，可能是外感寒濕損傷脾陽(yáng)，阻滯脾胃氣機(jī)、影響水液代謝的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。模型組小鼠出現(xiàn)的免疫系統(tǒng)紊亂可能是外感寒濕損傷脾陽(yáng)甚至一身之陽(yáng)，影響免疫機(jī)能的生物學(xué)基礎(chǔ)之一。模型組小鼠上調(diào)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，可能是外感寒濕致病的分子機(jī)制之一。
　　以散寒祛濕立法的加味腎著湯改善了模型組小鼠體重