草酸青霉半纖維素酶研究及其高效RNA干擾平臺構建.pdf

1、木質纖維素(lignocellulose)作為自然界中分布最廣、數(shù)量最多的可再生資源，其轉化為生物燃料的關鍵步驟是利用相關的酶將纖維素(cellulose)和半纖維素(hemicellulose)最大程度地糖化成為可發(fā)酵糖。目前，大多數(shù)市售的商品纖維素酶制劑中的半纖維素酶活性很低，不足以轉化木質纖維素材料中的半纖維素成分。而木質纖維素原料中未被降解的半纖維素會阻礙纖維素酶對纖維素的降解。因此，在纖維素酶中添加半纖維素酶很有可能大大提高纖

2、維素材料轉化為可發(fā)酵糖的效率。
　　長期以來，絲狀真菌是工業(yè)纖維素酶的主要生產(chǎn)菌株。然而絲狀真菌中重要纖維素降解酶不能有效表達一直是制約對其結構和功能深入研究的瓶頸，（如纖維二糖水解酶CBHI)。傳統(tǒng)的細菌和酵母表達系統(tǒng)在表達絲狀真菌來源的蛋白時有著自身的缺陷，而絲狀真菌具有很高的蛋白分泌能力和高效的蛋白折疊分泌體系，其具有成為理想的表達宿主的潛力，尤其在表達真核生物來源的蛋白時具有不可替代的優(yōu)勢。因此，絲狀真菌應該會是真菌來源的

3、木質纖維素降解酶的理想的表達宿主。
　　RNA干擾（RNAi）技術可以高效特異地使特定基因沉默，目前該技術已被廣泛用于基因功能探索和基因改造等方面。在絲狀真菌中，存在多核和易發(fā)生非同源重組的現(xiàn)象，傳統(tǒng)的基因敲除手段并不能很好地發(fā)揮作用，更為重要的是一些與調控相關的功能基因可能同時介導著菌體的生長，對這些基因進行研究時，使用基因敲除手段往往導致菌體致死而不能獲得該基因的缺失株，因此RNAi技術對于研究絲狀真菌功能基因有著重要的意義。

4、
　　圍繞著上述兩方面的研究目的，本論文的主要研究內(nèi)容如下:
　　一、十種半纖維素酶在草酸青霉Δ15A中的過表達及過表達菌株糖化能力研究
　　利用淀粉誘導條件下胞外蛋白分泌較低的草酸青霉Δ15A為蛋白表達宿主，用啟動子P15A高效過表達了草酸青霉114-2中不分泌或分泌量較低的十種半纖維素酶。SDS-PAGE顯示，這十種半纖維素酶在Δ15中均分別得到大量表達。然后以木糖渣和堿處理玉米秸稈為底物，用糖化實驗評價半纖維素酶

5、過表達菌株所產(chǎn)生的重組纖維素酶系的糖化能力。糖化結果顯示，除Aga27A外，其余9種半纖維素酶均能不同程度促進原纖維素酶系降解木糖渣或堿處理玉米秸稈的能力。其中Xyn10B，Xyn30A，Abf43C，Axe1A，F(xiàn)ae1A，Man5A對于木糖渣底物的降解的促進作用較明顯;而Xyn10B，Xyn10C，Xyn30A，Xyl3A，Axe1A，F(xiàn)ae1A對于堿處理玉米秸稈為底物時的降解作用的促進較明顯。
　　二、半纖維素酶在草酸青霉A

6、11Δ本源表達純化，酶學性質及應用研究
　　為了進一步研究篩選得到的7種半纖維素酶的性質和應用潛能，我們利用草酸青霉A11Δ表達宿主本源表達并純化了這7種半纖維素酶，SDS-PAGE顯示純化后的半纖維素酶達到了較高純度（電泳純），且蛋白濃度很高。在酶學性質實驗中我們分析了7種半纖維素酶的底物譜，并找到了其中4種酶的最適底物，確定了其中三個為木聚糖酶，一個為阿魏酸酯酶。通過分析溫度和pH對這4種半纖維素酶的活力影響，發(fā)現(xiàn)其中Xyn1

7、0B最適溫度為40℃，Xyn10C和Xyn30A的最適溫度均為60℃;Xyn30A最適反應pH為5,Xyn10B和Xyn10C的最適pH均為6;研究同時發(fā)現(xiàn)三種木聚糖中，Xyn10B的熱穩(wěn)定性較差。而阿魏酸酯酶Fae1A最適反應溫度為40℃，最適pH為7,其熱穩(wěn)定性測定結果顯示Fae1A有較好的熱穩(wěn)定性。
　　為了分析這7種半纖維素酶對降解纖維素材料的作用，我們分別測定了蛋白添加對賽諾纖維素酶和里氏木霉QM9414的發(fā)酵液糖化木糖

8、渣和堿處理玉米秸稈能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加Xyn10B，Xyn30A，Abf43C，Axe1A和Fae1A均能促進賽諾纖維素酶轉化木糖渣，其中Axe1A和Fae1A的促進效果較顯著;而添加Xyn10B，Xyn10C，Xyn30A和Axe1A能促進賽諾纖維素酶轉化堿處理玉米秸稈。在里氏木霉QM9414的纖維素酶系中添加Xyn10B，Xyn10C和Xyn30A能促進其轉化木糖渣的效率;而添加Axe1A，Xyn10B，Xyn10C和Xyn30A促

9、進其轉化堿處理玉米秸稈效果較明顯。實驗說明木聚糖酶和酯酶能促進纖維素材料的生物轉化。
　　三、草酸青霉中RNA干擾載體的構建及單基因和多基因干擾驗證
　　以pUC19為骨架質粒，從頭構建了RNA干擾載體pHX-RNAi，以草酸青霉114-2中的主要淀粉酶基因amy15A為報告基因進行打靶，分別用SDS-PAGE和RT-qPCR的方法驗證了對靶基因的干擾效果，結果證明干擾菌株Amy15A的表達受到了嚴重的抑制，而且這種抑制是通

10、過減少該基因mRNA的量實現(xiàn)的，這說明本實驗構建的RNA干擾載體是有效的。并且隨機挑選的7株轉化子的amy15A的基因表達均受到高效抑制，說明干擾載體pHX-RNAi能夠高效打靶目的基因。然后，我們將淀粉酶基因amy15A和外切酶基因ce174-2串聯(lián)到pHX-RNAi載體上進行了雙基因的干擾，通過酶活測定、蛋白電泳和RT-qPCR分析表明，amy15A和cel7A-2的表達量均受到高效抑制，說明pHX-RNAi可以通過一步操作沉默多個