草酸青霉半纖維素酶研究及其高效RNA干擾平臺(tái)構(gòu)建.pdf

1、木質(zhì)纖維素(lignocellulose)作為自然界中分布最廣、數(shù)量最多的可再生資源，其轉(zhuǎn)化為生物燃料的關(guān)鍵步驟是利用相關(guān)的酶將纖維素(cellulose)和半纖維素(hemicellulose)最大程度地糖化成為可發(fā)酵糖。目前，大多數(shù)市售的商品纖維素酶制劑中的半纖維素酶活性很低，不足以轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素材料中的半纖維素成分。而木質(zhì)纖維素原料中未被降解的半纖維素會(huì)阻礙纖維素酶對(duì)纖維素的降解。因此，在纖維素酶中添加半纖維素酶很有可能大大提高纖

2、維素材料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的效率。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，絲狀真菌是工業(yè)纖維素酶的主要生產(chǎn)菌株。然而絲狀真菌中重要纖維素降解酶不能有效表達(dá)一直是制約對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能深入研究的瓶頸，（如纖維二糖水解酶CBHI)。傳統(tǒng)的細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)絲狀真菌來(lái)源的蛋白時(shí)有著自身的缺陷，而絲狀真菌具有很高的蛋白分泌能力和高效的蛋白折疊分泌體系，其具有成為理想的表達(dá)宿主的潛力，尤其在表達(dá)真核生物來(lái)源的蛋白時(shí)具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。因此，絲狀真菌應(yīng)該會(huì)是真菌來(lái)源的

3、木質(zhì)纖維素降解酶的理想的表達(dá)宿主。
　　RNA干擾（RNAi）技術(shù)可以高效特異地使特定基因沉默，目前該技術(shù)已被廣泛用于基因功能探索和基因改造等方面。在絲狀真菌中，存在多核和易發(fā)生非同源重組的現(xiàn)象，傳統(tǒng)的基因敲除手段并不能很好地發(fā)揮作用，更為重要的是一些與調(diào)控相關(guān)的功能基因可能同時(shí)介導(dǎo)著菌體的生長(zhǎng)，對(duì)這些基因進(jìn)行研究時(shí)，使用基因敲除手段往往導(dǎo)致菌體致死而不能獲得該基因的缺失株，因此RNAi技術(shù)對(duì)于研究絲狀真菌功能基因有著重要的意義。

4、
　　圍繞著上述兩方面的研究目的，本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　一、十種半纖維素酶在草酸青霉Δ15A中的過(guò)表達(dá)及過(guò)表達(dá)菌株糖化能力研究
　　利用淀粉誘導(dǎo)條件下胞外蛋白分泌較低的草酸青霉Δ15A為蛋白表達(dá)宿主，用啟動(dòng)子P15A高效過(guò)表達(dá)了草酸青霉114-2中不分泌或分泌量較低的十種半纖維素酶。SDS-PAGE顯示，這十種半纖維素酶在Δ15中均分別得到大量表達(dá)。然后以木糖渣和堿處理玉米秸稈為底物，用糖化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)半纖維素酶

5、過(guò)表達(dá)菌株所產(chǎn)生的重組纖維素酶系的糖化能力。糖化結(jié)果顯示，除Aga27A外，其余9種半纖維素酶均能不同程度促進(jìn)原纖維素酶系降解木糖渣或堿處理玉米秸稈的能力。其中Xyn10B，Xyn30A，Abf43C，Axe1A，F(xiàn)ae1A，Man5A對(duì)于木糖渣底物的降解的促進(jìn)作用較明顯;而Xyn10B，Xyn10C，Xyn30A，Xyl3A，Axe1A，F(xiàn)ae1A對(duì)于堿處理玉米秸稈為底物時(shí)的降解作用的促進(jìn)較明顯。
　　二、半纖維素酶在草酸青霉A

6、11Δ本源表達(dá)純化，酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究
　　為了進(jìn)一步研究篩選得到的7種半纖維素酶的性質(zhì)和應(yīng)用潛能，我們利用草酸青霉A11Δ表達(dá)宿主本源表達(dá)并純化了這7種半纖維素酶，SDS-PAGE顯示純化后的半纖維素酶達(dá)到了較高純度（電泳純），且蛋白濃度很高。在酶學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)中我們分析了7種半纖維素酶的底物譜，并找到了其中4種酶的最適底物，確定了其中三個(gè)為木聚糖酶，一個(gè)為阿魏酸酯酶。通過(guò)分析溫度和pH對(duì)這4種半纖維素酶的活力影響，發(fā)現(xiàn)其中Xyn1

7、0B最適溫度為40℃，Xyn10C和Xyn30A的最適溫度均為60℃;Xyn30A最適反應(yīng)pH為5,Xyn10B和Xyn10C的最適pH均為6;研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)三種木聚糖中，Xyn10B的熱穩(wěn)定性較差。而阿魏酸酯酶Fae1A最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為7,其熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示Fae1A有較好的熱穩(wěn)定性。
　　為了分析這7種半纖維素酶對(duì)降解纖維素材料的作用，我們分別測(cè)定了蛋白添加對(duì)賽諾纖維素酶和里氏木霉QM9414的發(fā)酵液糖化木糖

8、渣和堿處理玉米秸稈能力的影響，發(fā)現(xiàn)添加Xyn10B，Xyn30A，Abf43C，Axe1A和Fae1A均能促進(jìn)賽諾纖維素酶轉(zhuǎn)化木糖渣，其中Axe1A和Fae1A的促進(jìn)效果較顯著;而添加Xyn10B，Xyn10C，Xyn30A和Axe1A能促進(jìn)賽諾纖維素酶轉(zhuǎn)化堿處理玉米秸稈。在里氏木霉QM9414的纖維素酶系中添加Xyn10B，Xyn10C和Xyn30A能促進(jìn)其轉(zhuǎn)化木糖渣的效率;而添加Axe1A，Xyn10B，Xyn10C和Xyn30A促

9、進(jìn)其轉(zhuǎn)化堿處理玉米秸稈效果較明顯。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明木聚糖酶和酯酶能促進(jìn)纖維素材料的生物轉(zhuǎn)化。
　　三、草酸青霉中RNA干擾載體的構(gòu)建及單基因和多基因干擾驗(yàn)證
　　以pUC19為骨架質(zhì)粒，從頭構(gòu)建了RNA干擾載體pHX-RNAi，以草酸青霉114-2中的主要淀粉酶基因amy15A為報(bào)告基因進(jìn)行打靶，分別用SDS-PAGE和RT-qPCR的方法驗(yàn)證了對(duì)靶基因的干擾效果，結(jié)果證明干擾菌株Amy15A的表達(dá)受到了嚴(yán)重的抑制，而且這種抑制是通

10、過(guò)減少該基因mRNA的量實(shí)現(xiàn)的，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的RNA干擾載體是有效的。并且隨機(jī)挑選的7株轉(zhuǎn)化子的amy15A的基因表達(dá)均受到高效抑制，說(shuō)明干擾載體pHX-RNAi能夠高效打靶目的基因。然后，我們將淀粉酶基因amy15A和外切酶基因ce174-2串聯(lián)到pHX-RNAi載體上進(jìn)行了雙基因的干擾，通過(guò)酶活測(cè)定、蛋白電泳和RT-qPCR分析表明，amy15A和cel7A-2的表達(dá)量均受到高效抑制，說(shuō)明pHX-RNAi可以通過(guò)一步操作沉默多個(gè)