松材線蟲纖維素酶系及其cDNA基因的克隆與RNA干擾研究.pdf

1、隨著全球一體化和國際社會交往與貿(mào)易往來的與日俱增，外來有害生物隨人口流動、動植物及其產(chǎn)品跨國擴散日益嚴重，給入侵地生態(tài)系統(tǒng)和國土安全造成巨大的災害性損失。松材線蟲（Bursaphelenchu xylophilus(Steiner&Buhrer) Nickle）已經(jīng)成為世界上重要的檢疫對象和我國有史以來危害最為嚴重的林業(yè)外來有害生物?；诮?jīng)典與現(xiàn)代生物學的理論與方法，國內(nèi)外眾多學者對松材線蟲的生物學、生態(tài)學和致病性等進行了深入研究，但是

2、迄今尚未有有效控制措施。本研究基于前人對松材線蟲致病過程中纖維素酶的認識，研究分析松材線蟲和近似種擬松材線蟲（B. mucronatus）分泌的纖維素酶系組成，纖維素酶系活力與線蟲遷移擴散能力的關系，以及纖維素酶相關編碼基因的克隆與功能鑒定，意圖闡明纖維素酶在松材線蟲致病過程中的分子機制，為松材線蟲病的可持續(xù)控制提供理論基礎。
　　采用真菌平板培養(yǎng)法研究了不同松材線蟲和擬松材線蟲株系的繁殖能力。在灰葡萄孢上培養(yǎng)10d，松材線蟲和擬

3、松材線蟲繁殖倍數(shù)分別達到248倍和373倍，而在松球殼孢上培養(yǎng)10d，松材線蟲和擬松材線蟲繁殖倍數(shù)分別為133和98倍。結合性比及幼蟲/成蟲指標數(shù)據(jù)，結果表明，在本實驗室條件下，線蟲在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）上繁殖速度最快，繁殖后得到合適數(shù)量的混合齡期線蟲；以反映線蟲繁殖能力的三個指標：繁殖倍數(shù)、性比和幼蟲/成蟲分析比較了供試的6個松材線蟲株系和4個擬松材線蟲株系，以松材線蟲Bx02、Bx03和擬松材線蟲Bm01表現(xiàn)

4、較高的繁殖能力。
　　分別采用羧甲基纖維素鈉（CMC）、微晶纖維素（MC）和水楊素（SC）三種底物，結合DNS定量分析法，研究了松材線蟲和擬松材線蟲體外分泌物中內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶三類酶的活性。結果表明，在離體培養(yǎng)條件下，松材線蟲和擬松材線蟲均能產(chǎn)生包括三類酶的完整纖維素酶系。其中，松材線蟲分泌物中三類酶活性明顯高于擬松材線蟲分泌物中這三類酶活性。在內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶中，松

5、材線蟲Bx01株系的酶活性最高為9.36μg·ml-1·min-1，擬松材線蟲Bm03株系的酶活性最高是6.32μg·ml-1·min-1，前者酶活性是后者的1.48倍；外切-β-1,4-葡聚糖酶酶活性最高的松材線蟲Bx01是6.67μg·ml-1·min-1，酶活性最高的擬松材線蟲Bm03是4.22μg·ml-1·min-1，前者是后者的1.58倍；Β-葡萄糖苷酶活性最高的松材線蟲Bx02株系為7.35μg·ml-1·min-1，&n

6、bsp;最高的擬松材線蟲Bm01株系為4.63μg·ml-1·min-1，前者是后者酶活性的1.59倍。方差分析和多重比較結果表明，松材線蟲Bx01、Bx02、Bx04、Bx05和Bx06株系內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活性同所有擬松材線蟲株系相比，結果達到極顯著差異。結合二者致病力的顯著差異，研究結果為更好的解釋松材線蟲致病機理提供了科學數(shù)據(jù)。
　　通過人工接種方法，比較了供試松材線蟲和擬松材線蟲株系在黑松枝段內(nèi)的遷移擴散和繁殖能

7、力。結果表明，與擬松材線蟲相比，松材線蟲在黑松枝段內(nèi)遷移能力更強，表現(xiàn)在以更快的速度和更大的種群數(shù)量穿過黑松枝段。多數(shù)松材線蟲株系在黑松枝段內(nèi)的繁殖力高于擬松材線蟲，并且多數(shù)松材線蟲株系繁殖數(shù)量同其中三個擬松材線蟲株系繁殖數(shù)量差異顯著。結合松材線蟲株系分泌的纖維素酶系活性明顯高于擬松材線蟲株系的纖維素酶系，纖維素酶可能是線蟲在寄主體內(nèi)遷移擴散的主要驅動力之一。
　　以松材線蟲總RNA為模板，運用RT-PCR技術分離和克隆了編碼松材

8、線蟲纖維素酶系組分之一的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因的cDNA片段（GenBank注冊號為EU660207）。經(jīng)T載體克隆、酶切鑒定和序列測定獲得cDNA片段為一個長678bp的完整的開放閱讀框，編碼全長為225個氨基酸的蛋白，同GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的日本松材線蟲內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因表現(xiàn)出較高的同源性，相似性為95％。用生物信息學方法分析和預測了編碼蛋白質(zhì)的主要特性。同源性分析表明，該蛋白同真菌中糖基水解酶相似性比較

9、高，同植物寄生線蟲和細菌的糖基水解酶相似性較低，證明該基因是來自真菌的水平基因漂移（HGT）。
　　進一步運用RANi技術鑒定了松材線蟲內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因的功能。熒光顯微鏡觀察結果表明，溶液浸泡可以把siRNA成功導入松材線蟲體內(nèi)，產(chǎn)生基因沉默效應。采用熒光定量PCR技術檢測松材線蟲內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因mRNA水平的表達抑制效應發(fā)現(xiàn)，siRNA15和siRNA275的沉默效率最高，siRNA581沉默基因的效