草酸青霉孢子發(fā)生和纖維素酶基因表達(dá)共調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組分，是地球上數(shù)量最豐富的可再生性資源。使用生物法降解木質(zhì)纖維素類(lèi)可再生資源，轉(zhuǎn)化獲得各種生物燃料和化工產(chǎn)品，減緩石油等不可再生資源的消耗，對(duì)保護(hù)環(huán)境、促進(jìn)全球經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。利用微生物，特別是絲狀真菌所產(chǎn)纖維素酶，將天然木質(zhì)纖維素高效地降解成為可發(fā)酵性糖是實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的核心關(guān)鍵。
　　草酸青霉是能夠分泌完全纖維素酶系的絲狀真菌，經(jīng)過(guò)多輪誘變得到的高產(chǎn)菌株JU-A10-T已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)

2、多年。研究草酸青霉纖維素酶調(diào)控機(jī)制，提高木質(zhì)纖維素等可再生資源的有效利用，對(duì)促進(jìn)人類(lèi)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。然而，經(jīng)過(guò)誘變篩選得到的纖維素酶高產(chǎn)菌株往往伴隨分生孢子形成能力的的大幅下降。因此，將絲狀真菌分生孢子產(chǎn)生和纖維素酶合成調(diào)控結(jié)合研究，將為進(jìn)一步擴(kuò)大高產(chǎn)菌株工業(yè)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。
　　本論文的主要研究結(jié)果如下:
　　1.全局性調(diào)控因子LaeA調(diào)控孢子發(fā)生和纖維素酶表達(dá)的初步研究
　　LaeA是絲狀真菌中

3、高度保守的全局性調(diào)控因子，對(duì)初級(jí)代謝、次級(jí)代謝及無(wú)性發(fā)育均有重要的調(diào)控作用。
　　草酸青霉laeA基因缺失后，在以葡萄糖、乳糖、甘油和微晶纖維素為唯一碳源表型平板上產(chǎn)孢能力顯著下降，表明LaeA具有調(diào)控分生孢子產(chǎn)生的作用。雙敲菌株△laeA△creA，幾乎不產(chǎn)分生孢子，表明纖維素酶合成的全局性調(diào)控因子CreA同樣是分生孢子產(chǎn)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。
　　LaeA敲除株在以微晶纖維素和麩皮為碳源培養(yǎng)時(shí)，在發(fā)酵前期，纖維素酶降解活力呈

4、上升趨勢(shì)，在發(fā)酵中后期，纖維素酶降解活力迅速下降，表明LaeA對(duì)纖維素酶的合成具有復(fù)雜的調(diào)控作用。主要纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量與酶活曲線一致，顯示LaeA對(duì)纖維素酶合成調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。在laeA缺失菌株中進(jìn)一步構(gòu)建的雙敲菌株△laeA△creA、過(guò)表達(dá)菌株△laeA-PgpdA∷clrB和△laeA-PgpdA∷xlnR，酶活曲線與laeA單缺失菌株一致，發(fā)酵前期，纖維素酶降解活力呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵中后期，纖維素酶降解活力迅速

5、下降。結(jié)果表明，LaeA是草酸青霉纖維素酶基因表達(dá)合成后期所必需的。在草酸青霉野生型菌株114-2和高產(chǎn)突變株JU-A10-T中過(guò)表達(dá)laeA，發(fā)現(xiàn)纖維素酶酶活略有下降。
　　2.LaeA介導(dǎo)BrlA調(diào)控孢子發(fā)生和纖維素酶表達(dá)的功能研究
　　在草酸青霉laeA缺失菌株中，孢子發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控因子brlA基因幾近沉默。BrlA的缺失阻礙了菌絲末端帚狀分支的形成，無(wú)分生孢子的生成，菌絲分支增加，菌落由綠色變?yōu)榘咨?br>　　Brl

6、A的缺失引起主要糖苷水解酶水平的上升，發(fā)酵第三天濾紙酶活比野生型提高了89.1％。胞外蛋白SDS-PAGE分析表明:brlA基因的缺失引起纖維素降解酶和淀粉酶蛋白的顯著表達(dá)，以及多種胞外蛋白表達(dá)的上調(diào)。熒光定量PCR的結(jié)果同樣支持了上述結(jié)果。序列分析發(fā)現(xiàn)纖維素酶基因啟動(dòng)子區(qū)大多含有假定的BrlA結(jié)合位點(diǎn)，表明BrlA是纖維素酶表達(dá)的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
　　由于多輪誘變后JU-A10-T基因組和轉(zhuǎn)錄組等發(fā)生很大變化，過(guò)表達(dá)BrlA在基