調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis AS)患者中的分布及功能.pdf

1、強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis AS）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，歐洲人群的發(fā)病率大約為0.55％，中國(guó)人群為0.23％。主要表現(xiàn)為累及脊柱和骨盆的慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎，引起疼痛、關(guān)節(jié)僵硬并受影響的區(qū)域進(jìn)展性的新骨形成和融合。因?yàn)榇_切的疾病發(fā)生和進(jìn)展的原因尚不清楚，目前針對(duì)于強(qiáng)直性脊柱炎治療只是癥狀上的緩解而不能完全根治。非甾類(lèi)抗炎藥(NSAID)可以減輕患者疼痛和僵硬感，但未證實(shí)其對(duì)骨性強(qiáng)直的進(jìn)展有何影響。柳氮

2、磺吡啶(SSZ)被證實(shí)治療AS有效，主要適用于改善患者的外周關(guān)節(jié)炎。相當(dāng)一部分AS患者采用常規(guī)的治療難以控制癥狀，而且缺乏證據(jù)證實(shí)這些治療可以抑制中軸關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展和改善疾病的預(yù)后。
　　早在1973年就發(fā)現(xiàn)HLA-B27等位基因是目前已知的強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis AS)的高危因素之一。比較流行的強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)病機(jī)制過(guò)程認(rèn)為許多細(xì)菌攜帶與內(nèi)源性的肽段相似的肽段，并能夠作為一種交互反應(yīng)的資源，通

3、過(guò)分子模擬激活，在AS患者體內(nèi)引發(fā)基于HLA-B27限制性的T細(xì)胞介導(dǎo)的的自身反應(yīng)。激活的CD8+T細(xì)胞攻擊關(guān)節(jié)組織處的自身抗原進(jìn)一步加重慢性炎癥。目前對(duì)HLA-B27在AS中的免疫病理作用形成了一些假說(shuō)，與這一假說(shuō)相互關(guān)聯(lián)，根據(jù)基因分型多種免疫相關(guān)基因與強(qiáng)直性脊柱炎的風(fēng)險(xiǎn)的具有相關(guān)性。然而，盡管80％的強(qiáng)直性脊柱炎攜帶患者HLA-B27，但在所有攜帶HLA-B27的人群中只有1-5％的人表現(xiàn)為強(qiáng)直性脊柱炎。此外，多項(xiàng)研究顯示突變和免疫

4、調(diào)節(jié)基因的表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，提示免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可以防止或加劇疾病的發(fā)展。
　　在小鼠模型和人類(lèi)疾病中研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞具有可以控制過(guò)度炎癥(excessive inflammation)和防止自身免疫性誘導(dǎo)(preventing autoimmuneinduction)的作用。在小鼠自身免疫模型中過(guò)繼移植CD1dhiCD5+B大幅度降低T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥。CD24+CD38+B抑制人體內(nèi)病毒特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。調(diào)節(jié)性 B細(xì)胞（regu

5、latoryB cells）產(chǎn)生抑制自身免疫炎癥反應(yīng)的機(jī)制雖然目前也認(rèn)為可能包括免疫抑制抗原呈遞等其他機(jī)制，但是現(xiàn)在主要認(rèn)為通過(guò)IL-10介導(dǎo)的。調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在自身免疫性疾病和炎癥性腸病的小鼠模型的作用發(fā)揮依賴于CD40信號(hào)。CD40在B細(xì)胞可以直接參與IL-10的產(chǎn)生。另外一個(gè)令人感興趣的現(xiàn)象是，在其他一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosusSLE)和免疫系血小板減少性紫癜（immu

6、ne thrombocytopenia ITP）相對(duì)于他們的正常人群而言，其CD24+CD38+B的調(diào)節(jié)功能存在缺陷。這些都暗示著在自身免疫性疾病中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞功能存在著缺陷。在本篇論文中我們主要研究強(qiáng)直性脊柱炎中B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制功能。
　　目的:
　　1、調(diào)查強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血中B細(xì)胞各個(gè)亞群的分部和比例。
　　2、AS患者中分泌IL-10的主要B細(xì)胞亞群
　　3、CD24+CD38+B細(xì)胞對(duì)CD8+T

7、細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
　　方法:
　　1.病例選取:總共選取30例患者，其中15例強(qiáng)直性脊柱炎患者（10例男性，5例女性），年齡在27到60歲之間。選擇性別和年齡匹配的15名健康成年人作為對(duì)照（10例男性，5例女性），年齡在25到65歲之間。所有強(qiáng)直性脊柱炎的患者診斷都按照修正的紐約標(biāo)準(zhǔn)診斷(modified New York criteria)。所有的強(qiáng)直性脊柱炎和健康對(duì)照組人群都是HLA-B27陽(yáng)性。在強(qiáng)制性脊柱炎標(biāo)本收集前患

8、者沒(méi)有使用非甾體類(lèi)抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drug)和/或者抗風(fēng)濕類(lèi)緩解藥物(disease-modifying anti-rheumatic drug)的治療。本研宄方案系經(jīng)通過(guò)了山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意后實(shí)施的，并且每位受試者在試驗(yàn)始前都被恰當(dāng)?shù)馗嬷嘘P(guān)本項(xiàng)臨床研宄的目的、方法、預(yù)期效益、潛在危險(xiǎn)及可能要承受的不適，自愿地簽署知情同意書(shū)。外周血的單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral

9、 bloodmononuclear cells PBMCs)在病人診斷時(shí)抽取血液后通過(guò)Ficoll離心獲得。新鮮細(xì)胞直接用于IL-10分泌和B細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè);對(duì)于T細(xì)胞和B細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞在-80℃溫度冰箱中冷藏至少1月，然后解凍在37℃5％ CO2條件下過(guò)夜后備用。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)
　　細(xì)胞表面染色，PBMCs懸浮在FACS染色Buffer(PBS supplemented with1％ BSA,2nM EDTA

10、and0.1％ sodium azide)中。細(xì)胞表面抗體包括抗人CD3、CD8、CD19，CD20, CD21, CD24、CD27、CD38(BioLegend)、CD45RA、CD45RO、CD62L和/或IgD(BD)，連同LIVE/DEAD Fixable Aqua(Invitrogen)，在4℃條件下孵育30分鐘。用FACS Buffer2ml洗滌2次，傾倒后濾紙吸干管口液體。細(xì)胞內(nèi)染色，表面染色的細(xì)胞在CytoFix/Cy

11、toPerm(BD)混勻，4度孵育20分鐘，在1X Perm/Wash(BD)洗滌一次，然后直接加入細(xì)胞因子anti-human IL-10，IFN-gamma和/o或TNF-alphaantibodies抗體，4℃條件下孵育30分鐘，然后洗滌兩次。
　　結(jié)果:
　　1.1 我們分析強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常對(duì)照組B細(xì)胞在外周循環(huán)中單個(gè)核細(xì)胞的比例。由于CD19是B淋巴細(xì)胞分化過(guò)程的一個(gè)重要譜系特異性表面標(biāo)志，從最開(kāi)始的祖B細(xì)胞

12、階段開(kāi)始表達(dá)CD19，表達(dá)過(guò)程一直持續(xù)到B淋巴細(xì)胞分化的終末時(shí)期，而CD3是特異性T淋巴細(xì)胞表達(dá)的譜系特異性表面標(biāo)志。因此，我們通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)和對(duì)比強(qiáng)直性脊柱炎和健康對(duì)照外周靜脈血中CD3-CD19+B細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者外周循環(huán)B細(xì)胞和健康對(duì)照相比無(wú)顯著變化。
　　1.2 由于強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人群外周循環(huán)CD3-CD19+B細(xì)胞兩者無(wú)明顯差異，我們進(jìn)一步分析B細(xì)胞亞群的變化，探究B細(xì)胞亞群

13、原始B細(xì)胞、活化B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿母細(xì)胞和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在強(qiáng)直性脊柱炎炎癥進(jìn)程中所發(fā)揮的作用。最后B細(xì)胞比例方面我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者中含有更高比例的CD20hiCD21lo活化B細(xì)胞、IgD-CD27+記憶B細(xì)胞和CD19loCD20-CD27hi漿母細(xì)胞，而健康成人中含有更高比例的IgD+CD27-原始B細(xì)胞。在AS和健康人群中調(diào)節(jié)性CD24+CD38+B細(xì)胞無(wú)明顯差異。
　　2.1 CD19loCD20-CD27hi漿細(xì)

14、胞和CD24+CD38+B細(xì)胞都具有產(chǎn)生IL-10的功能。我們檢測(cè)了在AS患者中IL-10的分泌。B細(xì)胞根據(jù)他們的表面標(biāo)記分別分選后單獨(dú)培養(yǎng)。由于健康成年人外周血中含有極低數(shù)量的漿細(xì)胞，我們未能從中分選出足夠的漿細(xì)胞。
　　2.2 分離AS患者和健康對(duì)照組的漿細(xì)胞和CD24+CD38+亞群B細(xì)胞。在CD40和BCR共刺激培養(yǎng)72小時(shí)后，Luminex測(cè)定細(xì)胞內(nèi)IL-10含量。AS患者中無(wú)論漿細(xì)胞還是CD24+CD38+亞群B細(xì)胞分

15、泌IL-10的能力都較正常對(duì)照組明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1、檢測(cè)強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人群外周循環(huán)B細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者和正常人群CD19+B細(xì)胞兩者無(wú)明顯差異。在B細(xì)胞比例方面我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎患者中含有更高比例的CD20hiCD21lo活化B細(xì)胞IgD-CD27+記憶B細(xì)胞和CD19loCD20-CD27hi漿母細(xì)胞，而健康成人中含有更高比例的IgD+CD27-原始B細(xì)胞。在兩者中CD24+CD38+無(wú)明

16、顯差異。
　　2、我們發(fā)現(xiàn)在直接離體條件下，健康人群中除了CD24+CD38+B細(xì)胞以外幾乎所有的B細(xì)胞亞群分泌極少量的IL-10。在經(jīng)過(guò)CD40+BCR刺激后健康人群中CD24+CD38+B細(xì)胞相比較AS患者中分泌更多的IL-10。在AS患者CD24+CD38+B細(xì)胞離體條件下在沒(méi)有刺激情況下分泌和CD20-CD27hi漿細(xì)胞差不多量的IL-10，在CD40+BCR刺激條件下稍多。CD24+CD38+B在外周血B細(xì)胞中呈現(xiàn)的細(xì)胞

17、比例更高，我們推測(cè)在體內(nèi)CD24+CD38+B IL-10的主要來(lái)源。這種推測(cè)被流失細(xì)胞染色所證實(shí)，我們所證實(shí)產(chǎn)生IL-10的細(xì)胞主要是CD24+CD38+亞群B細(xì)胞。
　　3、來(lái)源于正常人群的CD24+CD38+B細(xì)胞可以強(qiáng)有力的抑制CD8+T細(xì)胞的活化。這種抑制作用不是通過(guò)IL-10實(shí)現(xiàn)的，共培養(yǎng)體系中加入IL-10抗體后并不能逆轉(zhuǎn)這種抑制過(guò)程。在AS患者中CD27h漿細(xì)胞和CD24+CD38+細(xì)胞都不能抑制CD8+T細(xì)胞的激