調(diào)節(jié)性B細胞在強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis AS)患者中的分布及功能.pdf

1、強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis AS）是一種常見的自身免疫性疾病，歐洲人群的發(fā)病率大約為0.55％，中國人群為0.23％。主要表現(xiàn)為累及脊柱和骨盆的慢性炎癥性關節(jié)炎，引起疼痛、關節(jié)僵硬并受影響的區(qū)域進展性的新骨形成和融合。因為確切的疾病發(fā)生和進展的原因尚不清楚，目前針對于強直性脊柱炎治療只是癥狀上的緩解而不能完全根治。非甾類抗炎藥(NSAID)可以減輕患者疼痛和僵硬感，但未證實其對骨性強直的進展有何影響。柳氮

2、磺吡啶(SSZ)被證實治療AS有效，主要適用于改善患者的外周關節(jié)炎。相當一部分AS患者采用常規(guī)的治療難以控制癥狀，而且缺乏證據(jù)證實這些治療可以抑制中軸關節(jié)病變的進展和改善疾病的預后。
　　早在1973年就發(fā)現(xiàn)HLA-B27等位基因是目前已知的強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis AS)的高危因素之一。比較流行的強直性脊柱炎的發(fā)病機制過程認為許多細菌攜帶與內(nèi)源性的肽段相似的肽段，并能夠作為一種交互反應的資源，通

3、過分子模擬激活，在AS患者體內(nèi)引發(fā)基于HLA-B27限制性的T細胞介導的的自身反應。激活的CD8+T細胞攻擊關節(jié)組織處的自身抗原進一步加重慢性炎癥。目前對HLA-B27在AS中的免疫病理作用形成了一些假說，與這一假說相互關聯(lián)，根據(jù)基因分型多種免疫相關基因與強直性脊柱炎的風險的具有相關性。然而，盡管80％的強直性脊柱炎攜帶患者HLA-B27，但在所有攜帶HLA-B27的人群中只有1-5％的人表現(xiàn)為強直性脊柱炎。此外，多項研究顯示突變和免疫

4、調(diào)節(jié)基因的表達之間的關聯(lián)，提示免疫調(diào)節(jié)機制可以防止或加劇疾病的發(fā)展。
　　在小鼠模型和人類疾病中研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性B細胞具有可以控制過度炎癥(excessive inflammation)和防止自身免疫性誘導(preventing autoimmuneinduction)的作用。在小鼠自身免疫模型中過繼移植CD1dhiCD5+B大幅度降低T細胞介導的炎癥。CD24+CD38+B抑制人體內(nèi)病毒特異性的T細胞反應。調(diào)節(jié)性 B細胞（regu

5、latoryB cells）產(chǎn)生抑制自身免疫炎癥反應的機制雖然目前也認為可能包括免疫抑制抗原呈遞等其他機制，但是現(xiàn)在主要認為通過IL-10介導的。調(diào)節(jié)性B細胞在自身免疫性疾病和炎癥性腸病的小鼠模型的作用發(fā)揮依賴于CD40信號。CD40在B細胞可以直接參與IL-10的產(chǎn)生。另外一個令人感興趣的現(xiàn)象是，在其他一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosusSLE)和免疫系血小板減少性紫癜（immu

6、ne thrombocytopenia ITP）相對于他們的正常人群而言，其CD24+CD38+B的調(diào)節(jié)功能存在缺陷。這些都暗示著在自身免疫性疾病中調(diào)節(jié)性B細胞功能存在著缺陷。在本篇論文中我們主要研究強直性脊柱炎中B細胞介導的免疫抑制功能。
　　目的:
　　1、調(diào)查強直性脊柱炎患者外周血中B細胞各個亞群的分部和比例。
　　2、AS患者中分泌IL-10的主要B細胞亞群
　　3、CD24+CD38+B細胞對CD8+T

7、細胞的調(diào)節(jié)作用
　　方法:
　　1.病例選取:總共選取30例患者，其中15例強直性脊柱炎患者（10例男性，5例女性），年齡在27到60歲之間。選擇性別和年齡匹配的15名健康成年人作為對照（10例男性，5例女性），年齡在25到65歲之間。所有強直性脊柱炎的患者診斷都按照修正的紐約標準診斷(modified New York criteria)。所有的強直性脊柱炎和健康對照組人群都是HLA-B27陽性。在強制性脊柱炎標本收集前患

8、者沒有使用非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drug)和/或者抗風濕類緩解藥物(disease-modifying anti-rheumatic drug)的治療。本研宄方案系經(jīng)通過了山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會的同意后實施的，并且每位受試者在試驗始前都被恰當?shù)馗嬷嘘P本項臨床研宄的目的、方法、預期效益、潛在危險及可能要承受的不適，自愿地簽署知情同意書。外周血的單個核細胞(Peripheral

9、 bloodmononuclear cells PBMCs)在病人診斷時抽取血液后通過Ficoll離心獲得。新鮮細胞直接用于IL-10分泌和B細胞表面標志的檢測;對于T細胞和B細胞培養(yǎng)，細胞在-80℃溫度冰箱中冷藏至少1月，然后解凍在37℃5％ CO2條件下過夜后備用。
　　2.流式細胞技術
　　細胞表面染色，PBMCs懸浮在FACS染色Buffer(PBS supplemented with1％ BSA,2nM EDTA

10、and0.1％ sodium azide)中。細胞表面抗體包括抗人CD3、CD8、CD19，CD20, CD21, CD24、CD27、CD38(BioLegend)、CD45RA、CD45RO、CD62L和/或IgD(BD)，連同LIVE/DEAD Fixable Aqua(Invitrogen)，在4℃條件下孵育30分鐘。用FACS Buffer2ml洗滌2次，傾倒后濾紙吸干管口液體。細胞內(nèi)染色，表面染色的細胞在CytoFix/Cy

11、toPerm(BD)混勻，4度孵育20分鐘，在1X Perm/Wash(BD)洗滌一次，然后直接加入細胞因子anti-human IL-10，IFN-gamma和/o或TNF-alphaantibodies抗體，4℃條件下孵育30分鐘，然后洗滌兩次。
　　結(jié)果:
　　1.1 我們分析強直性脊柱炎患者和正常對照組B細胞在外周循環(huán)中單個核細胞的比例。由于CD19是B淋巴細胞分化過程的一個重要譜系特異性表面標志，從最開始的祖B細胞

12、階段開始表達CD19，表達過程一直持續(xù)到B淋巴細胞分化的終末時期，而CD3是特異性T淋巴細胞表達的譜系特異性表面標志。因此，我們通過流式細胞技術分別檢測和對比強直性脊柱炎和健康對照外周靜脈血中CD3-CD19+B細胞占單個核細胞的比例，發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者外周循環(huán)B細胞和健康對照相比無顯著變化。
　　1.2 由于強直性脊柱炎患者和正常人群外周循環(huán)CD3-CD19+B細胞兩者無明顯差異，我們進一步分析B細胞亞群的變化，探究B細胞亞群

13、原始B細胞、活化B細胞、記憶B細胞、漿母細胞和調(diào)節(jié)性B細胞在強直性脊柱炎炎癥進程中所發(fā)揮的作用。最后B細胞比例方面我們發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者中含有更高比例的CD20hiCD21lo活化B細胞、IgD-CD27+記憶B細胞和CD19loCD20-CD27hi漿母細胞，而健康成人中含有更高比例的IgD+CD27-原始B細胞。在AS和健康人群中調(diào)節(jié)性CD24+CD38+B細胞無明顯差異。
　　2.1 CD19loCD20-CD27hi漿細

14、胞和CD24+CD38+B細胞都具有產(chǎn)生IL-10的功能。我們檢測了在AS患者中IL-10的分泌。B細胞根據(jù)他們的表面標記分別分選后單獨培養(yǎng)。由于健康成年人外周血中含有極低數(shù)量的漿細胞，我們未能從中分選出足夠的漿細胞。
　　2.2 分離AS患者和健康對照組的漿細胞和CD24+CD38+亞群B細胞。在CD40和BCR共刺激培養(yǎng)72小時后，Luminex測定細胞內(nèi)IL-10含量。AS患者中無論漿細胞還是CD24+CD38+亞群B細胞分

15、泌IL-10的能力都較正常對照組明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1、檢測強直性脊柱炎患者和正常人群外周循環(huán)B細胞。我們發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者和正常人群CD19+B細胞兩者無明顯差異。在B細胞比例方面我們發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者中含有更高比例的CD20hiCD21lo活化B細胞IgD-CD27+記憶B細胞和CD19loCD20-CD27hi漿母細胞，而健康成人中含有更高比例的IgD+CD27-原始B細胞。在兩者中CD24+CD38+無明

16、顯差異。
　　2、我們發(fā)現(xiàn)在直接離體條件下，健康人群中除了CD24+CD38+B細胞以外幾乎所有的B細胞亞群分泌極少量的IL-10。在經(jīng)過CD40+BCR刺激后健康人群中CD24+CD38+B細胞相比較AS患者中分泌更多的IL-10。在AS患者CD24+CD38+B細胞離體條件下在沒有刺激情況下分泌和CD20-CD27hi漿細胞差不多量的IL-10，在CD40+BCR刺激條件下稍多。CD24+CD38+B在外周血B細胞中呈現(xiàn)的細胞

17、比例更高，我們推測在體內(nèi)CD24+CD38+B IL-10的主要來源。這種推測被流失細胞染色所證實，我們所證實產(chǎn)生IL-10的細胞主要是CD24+CD38+亞群B細胞。
　　3、來源于正常人群的CD24+CD38+B細胞可以強有力的抑制CD8+T細胞的活化。這種抑制作用不是通過IL-10實現(xiàn)的，共培養(yǎng)體系中加入IL-10抗體后并不能逆轉(zhuǎn)這種抑制過程。在AS患者中CD27h漿細胞和CD24+CD38+細胞都不能抑制CD8+T細胞的激