低密度脂蛋白-羧甲基纖維素鈉納米凝膠靶向遞送體系研究.pdf

1、蛋白質(zhì)/多糖自組裝納米粒子由于其安全無(wú)毒、制備簡(jiǎn)單、表面易修飾、載藥量高、控釋性能好等優(yōu)勢(shì)，在藥物遞送方面越來(lái)越受關(guān)注。但這些納米粒子只能通過(guò)滲透-保留作用被動(dòng)積累于腫瘤組織，為進(jìn)一步提高藥物療效、降低毒副性，用靶向配體修飾納米粒子，構(gòu)建主動(dòng)靶向蛋白質(zhì)/多糖納米載藥體系，成為研究熱點(diǎn)。本文選用低密度脂蛋白(LDL)和羧甲基纖維素鈉(CMC)作為原料，通過(guò)綠色簡(jiǎn)單的自組裝法制備新型LDL/CMC納米凝膠。以DOX為模型藥物，研究LDL/C

2、MC納米凝膠的載藥和體外緩釋特性，并評(píng)價(jià)其體外抗癌活性。在此基礎(chǔ)上，為提高DOX-LDL/CMC納米凝膠抗腫瘤療效，通過(guò)酯化反應(yīng)將葉酸與羧甲基纖維素鈉偶聯(lián)(FA-CMC)，采用加熱法和離子交聯(lián)法優(yōu)化制備葉酸主動(dòng)靶向載藥納米凝膠(DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL)，研究其理化特性，并對(duì)體外釋放行為和細(xì)胞靶向性進(jìn)行探討。研究發(fā)現(xiàn)，這種新型靶向載藥納米粒子不但能實(shí)現(xiàn)DOX的pH響應(yīng)性釋放，還具有葉酸靶向功能

3、，能促進(jìn)DOX的腫瘤靶向遞送，增加腫瘤細(xì)胞的攝取，提高藥物療效，具有良好的應(yīng)用前景。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.以雞蛋低密度脂蛋白(LDL)和羧甲基纖維素鈉(CMC)為原料，通過(guò)綠色簡(jiǎn)單的自組裝法制備LDL/CMC納米凝膠。探討質(zhì)量比、pH、加熱對(duì)LDL/CMC納米粒子的影響，DLS和TEM結(jié)果表明，最佳LDL/CMC納米粒子是平均粒徑為90 nm的球形納米粒子，其多分散系數(shù)為0.3，ζ-電位為-35 mV。LD

4、L與CMC主要靠靜電相互作用和疏水相互作用自組裝形成LDL/CMC納米粒子。LDL/CMC納米粒子很可能具有核殼結(jié)構(gòu)，主要以CMC為殼，致使LDL/CMC納米粒子在pH3.0～10.0范圍內(nèi)不發(fā)生聚集或解離，粒徑穩(wěn)定。此外，在4℃條件下納米粒子在等滲溶液中可保存數(shù)月。其凍干粉末樣品可重新水合分散，納米粒子基本性質(zhì)不發(fā)生顯著變化。
　　2.以阿霉素(DOX)作為模型藥物，對(duì)DOX-LDL/CMC納米凝膠載藥、體外釋放、細(xì)胞毒性及細(xì)胞

5、攝取進(jìn)行研究。在靜電和疏水相互作用下，LDL/CMC納米粒子實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿霉素的高效負(fù)載。當(dāng)DOX濃度為100μg/mL時(shí)， DOX-LDL/CMC的載藥率最高98.219％，粒徑最小123.7 nm，且ζ-電位為-38.2mV。另外，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明DOX-LDL/CMC納米凝膠中DOX的釋放具有pH響應(yīng)性，在生理?xiàng)l件下(pH7.4)釋放緩慢，而在弱酸性條件下(pH6.2)釋放加快。此外，DOX-LDL/CMC納米粒子能有效被腫瘤細(xì)胞攝取

6、而殺死細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DOX-LDL/CMC納米粒子對(duì)HeLa和HepG2細(xì)胞的半抑制濃度IC50分別為游離DOX的2.45和1.72倍，DOX被LDL/CMC納米粒子包載后細(xì)胞毒性顯著降低。通過(guò)CLSM和FCM研究可知，與裸藥DOX相比，DOX-LDL/CMC納米粒子通過(guò)較慢的內(nèi)吞作用進(jìn)入HepG2細(xì)胞，紅色熒光強(qiáng)度低，DOX的蓄積少，從而使細(xì)胞毒性降低。
　　3.利用偶聯(lián)劑(EDC)將葉酸與羧甲基纖維素鈉偶聯(lián)，制得偶

7、聯(lián)物FA-CMC。紫外光譜、紅外光譜、1H-NMR核磁共振光譜和XPS能譜結(jié)果均證明了FA與CMC已成功偶聯(lián)。XRD和DSC分析表明偶聯(lián)前后CMC的晶型結(jié)構(gòu)和熱特性均存在一定差異。當(dāng)FA與CMC質(zhì)量比為3∶1時(shí)，偶聯(lián)比最高達(dá)到4.1％。探索制備靶向納米粒子的最佳條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加熱法制備的最佳靶向納米凝膠(FA-CMC/LDL)，其平均粒徑為124 nm，多分散系數(shù)為0.3，ζ-電位為-35 mV。離子交聯(lián)法制備的最佳靶向納米凝膠(

8、Ca2+-FA-CMC/LDL)，其平均粒徑為152nm，多分散系數(shù)為0.26，ζ-電位為-30 mV。DLS和TEM分析結(jié)果顯示，與FA-CMC/LDL納米粒子相比，Ca2+-FA-CMC/LDL納米粒子更大，分散性更好，形態(tài)更加規(guī)則。此外，在4℃條件下儲(chǔ)藏90天后，這兩種納米粒子均未出現(xiàn)沉淀，穩(wěn)定性較好。
　　4.選用最佳的靶向納米凝膠FA-CMC/LDL和Ca2+-FA-CMC/LDL負(fù)載DOX，研究其載藥和體外釋放特性，并

9、對(duì)細(xì)胞靶向性進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)DOX濃度為80μg/mL時(shí)，DOX-FA-CMC/LDL納米粒子載藥率高達(dá)96.576％，其平均粒徑為136.07 nm，多分散系數(shù)為0.431，ζ-電位為-28.50 mV;而對(duì)于DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL納米粒子，其平均粒徑為196.93 nm，多分散系數(shù)為0.278，ζ-電位為-24.30 mV，載藥率為97.245％。另外，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明，DOX-FA-CMC/LDL納米粒子和Ca2+-F

10、A-CMC/LDL納米粒子對(duì)DOX的釋放均具有pH響應(yīng)性，且DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL納米粒子的控釋效果更好。此外，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于FR陽(yáng)性KB細(xì)胞，DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL的細(xì)胞毒性明顯高于DOX-LDL/CMC。而對(duì)于FR陰性A549細(xì)胞，游離DOX的細(xì)胞毒性大于三種載藥納米粒子(DOX-LDL/CMC，DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca+-FA-CMC/LDL