微小RNA-206及其靶基因GJA1（間隙連接蛋白43基因）在激素性股骨頭壞死中的作用研究.pdf

1、目的：
　　目的：
　　miRNA是生物體內(nèi)源長度約為21個核苷酸左右的非編碼小RNA，通過與靶mRNA分子3'末端非翻譯區(qū)域(3'-untranslated region，3'UTR)互補配對而在轉錄水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導致mRNA的翻譯抑制或者降解從而發(fā)揮生物調(diào)控功能[1]?，F(xiàn)有研究表明骨組織的發(fā)生、生長、代謝同樣與miRNA有著密切的關聯(lián)。連接子蛋白43(connexin43，Cx43)是骨組織中主要的間隙連

2、接(gap junction)蛋白和半通道(hemichannel)蛋白，由Cx43形成的間隙連接及半通道實現(xiàn)了骨組織細胞間的直接通訊，對骨組織的正常發(fā)育、骨重建過程的建立與平衡起重要作用[2，3]。已有研究表明miRNA-206以間隙連接蛋白43為靶基因對成骨細胞的生物學行為產(chǎn)生影響[4]。而成骨細胞是骨發(fā)育重建過程中最重要細胞之一，在骨骼發(fā)育成熟和修復重建中具有重要作用，其數(shù)量、功能的改變與股骨頭壞死密切相關[5,6]。我們假設激素

3、性股骨頭壞死的病理發(fā)生發(fā)展與Cx43/miRNA-206調(diào)控的成骨細胞分化通路相關。本實驗以miRNA-206為中心，從分子生物學水平、細胞水平對Cx43/miRNA-206調(diào)控的成骨細胞分化通路在激素性股骨頭壞死中的作用深入研究，為研究激素性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機制提供新的思路。
　　方法與結果：
　　一、miRNA-206及其靶基因GJA1（間隙連接蛋白43基因）在激素性股骨頭壞死骨組織中的表達變化
　　方法:<

4、br>　　(1)收集激素性股骨頭壞死與股骨頸骨折行全髖置換手術患者的股骨頭標本46例，其中激素性股骨頭缺血性壞死（實驗組）26例;新鮮股骨頸骨折（對照組）20例
　　(2)HE染色觀察兩組股骨頭組織形態(tài)變化
　　(3)免疫組織化學檢測CX43蛋白在股骨頭的表達
　　(4)提取患者股骨頭總RNA實時熒光定量PCR檢測兩組股骨頭miRNA-206及CX43mRNA的表達情況
　　(5)提取患者股骨頭總蛋白質(zhì)，west

5、ern blot定量檢測股骨頭CX43蛋白的表達
　　結果:
　　(1)HE染色:實驗組:骨小梁壞死，細胞核消失，骨髓造血及微循環(huán)障礙;對照組:骨小梁內(nèi)有少量壞死骨細胞，骨髓腔造血細胞增生活躍。
　　(2)免疫組化:Cx43蛋白陽性表達于骨細胞、成骨細胞及細胞與細胞之間的胞膜和胞漿上。
　　(3)熒光定量PCR:miRNA-206在實驗組的表達量是對照組的4.3倍，兩組具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，CX43mR

6、NA在對照組的表達是實驗組的2.4倍，兩者間具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　(4)Western blot: CX43蛋白的表達在實驗組中低于對照組，兩者具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　二、miRNA-206通過抑制Cx43的表達而參與成骨細胞的調(diào)控
　　方法:
　　(1)成骨細胞株人SV40轉染成骨細胞株購于（中國科學院細胞庫）;
　　(2)向原代成骨細胞內(nèi)轉染miRNA-206的mimic（

7、模擬劑）和inhibitor（抑制劑）及陰性對照N.C;
　　(3)采用qRT-PCR檢測miRNA-206、Cx43的mRNA表達及Western-blot方法檢測Cx43蛋白表達水平，CCK-8法檢測細胞增殖能力，ALP底物顯色反應來評價轉染后成骨細胞功能變化。
　　結果:
　　(1)轉染miRNA-206 mimic后，細胞中miRNA-206表達明顯增加，Cx43蛋白表達下降，與陰性對照比較具有統(tǒng)計學差異(P＜

8、0.05)，Cx43mRNA表達不變，與陰性對照比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);成骨細胞數(shù)量與N.C.對照組相比均顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);成骨細胞特異性分化標志物ALP活性下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　(2)轉染miRNA-206inhibitor后，細胞中miRNA-206表達明顯下降，Cx43蛋白表達增加，與陰性對照比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)Cx43mRNA表達不變，與陰性對照

9、比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);成骨細胞數(shù)量與正常對照組和N.C.對照組相比均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);成骨細胞增殖能力增強，成骨細胞特異性分化標志物ALP活性增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　(1)在激素性股骨頭壞死骨組織中，miRNA-206表達上調(diào)，CX43表達下調(diào);
　　(2)miRNA-206通過抑制Cx43的表達，從而抑制成骨細胞增殖、分化;
　　(3)