RanBPM與prelamin A相互作用的驗證和RanBPM功能的初步研究.pdf

1、[目的]A型核纖層蛋白前體(prelaminA)加工成熟出現(xiàn)異常則導致兒童早老癥(HGPS)的出現(xiàn),HGPS患者中細胞胞核結構和功能出現(xiàn)不同程度的異常,包括特征性的核畸形、DNA損傷加重、某些核蛋白表達下調(diào)等。在正常衰老的老年個體皮膚成纖維細胞中也發(fā)現(xiàn)有類似于HGPS患者細胞胞核畸變的現(xiàn)象。推測prelamin A及其相互作用蛋白在HGPS患者和人體生理性衰老過程中均發(fā)揮著重要作用。RanBPM(RanBP9,Ran Binding P

2、rotein in the Microtubule-OrganizingCenter)因在中心體參與微管的成核過程而命名,在哺乳動物組織中廣泛表達而又高度保守,參與微管的動態(tài)變化、細胞遷移、核運動以及染色體的分離、蛋白與蛋白之間的相互作用等。本實驗室前期工作通過酵母雙雜交技術初步證明RanBPM是一個與prelamin A相互作用的蛋白,本研究進一步通過細胞外蛋白沉降實驗(GST pull-down analysis)、免疫共沉淀(Co

3、-immunoprecipitation)實驗及細胞內(nèi)定位等方法證明其與prelamin A在細胞內(nèi)外的相互作用,并初步探討該蛋白在細胞衰老中的作用。
　　 [方法]構建原核表達載體pET-32a-RanBPM,分別進行RanBPM和prelaminA的原核表達,通過GST pull-down實驗證明兩者在體外的相互作用;構建真核表達載體pEGFP-N1-RanBPM,將pCMV-myc-PLA和pEGFP-N1-RanBPM質(zhì)

4、粒共轉染HEK-293細胞,進行免疫共沉淀實驗。將構建的pEGFP-N1-RanBPM和pDsRedl-N1-prelamin A融合表達質(zhì)粒轉染人胚腎細胞293(HEK-293),熒光顯微鏡下觀察RanBPM與prelamin A共定位情況。采用RT-PCR等方法檢測RanBPM在HEK-293和HEK-293PLA細胞中mRNA轉錄水平,從而初步探討RanBPM在衰老細胞中的作用。
　　 [結果]成功構建原核表達載體pET-

5、32a-RanBPM,通過GST pull-down實驗驗證了RanBPM和prelamin A在細胞外有相互作用;成功構建真核表達載體pEGFP-N1-RanBPM,通過免疫共沉淀實驗,進一步證明了RanBPM和prelaminA在HEK-293細胞內(nèi)有相互作用:細胞定位觀察結果表明RanBPM在細胞胞核和胞漿均有表達,與prelamin A在HEK-293細胞核膜上共定位。PCR結果顯示RanBPM在HEK-293PLA細胞中mRN