TPO受體胞內(nèi)區(qū)相互作用蛋白的篩選與初步功能研究.pdf

1、TPO是重要的造血生長因子，主要調(diào)控巨核細(xì)胞的增殖和血小板的生成，并能與其它因子協(xié)同作用，支持多能造血祖細(xì)胞的存活和分化。TPO通過與細(xì)胞膜上的TPO受體(Mpl)結(jié)合而發(fā)揮作用，研究Mpl的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對理解TPO廣泛的生理作用有重要意義。 當(dāng)TPO與Mpl結(jié)合時(shí)，Mpl形成同源二聚體，激活與之結(jié)合的Janus激酶(JAK2)，引起受體胞內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基的磷酸化，從而引發(fā)下游STAT、Ras/Raf/MAPK、PI3K等多條信

2、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)缺失c-Mpl胞內(nèi)區(qū)近膜的10個(gè)氨基酸，TPO與c-Mpl結(jié)合便不能激活JAK2，但Raf、MAPK、PI3K仍可被激活；而去除Mpl胞內(nèi)區(qū)所有酪氨酸殘基，TPO仍可支持TPO依賴細(xì)胞株的增殖，這些都說明細(xì)胞內(nèi)尚存在其他未被認(rèn)識的TPO受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。尋找新的介導(dǎo)TPO信號的蛋白質(zhì)是本研究的目的。 我們以Mpl胞內(nèi)區(qū)蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交的方法從小鼠胎肝文庫中釣取了16個(gè)可能同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用

3、的基因片段；然后通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選，去除其中2個(gè)在此系統(tǒng)下同Mpl沒有相互作用的片段；在剩余的14個(gè)基因片段中，通過對基因的功能和細(xì)胞內(nèi)定位分析，選取了8個(gè)可能同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用的基因片段繼續(xù)研究，克隆了此8個(gè)基因片段的全長序列，并利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)雙雜交實(shí)驗(yàn)對全長基因同Mpl的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果這8個(gè)全長基因同Mpl胞內(nèi)區(qū)均存在相互作用。我們選取其中的兩條基因(RACK1和Atp5d)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

4、 RACK1是激活的PKC的受體，具有銜接蛋白的功能，已證實(shí)與許多信號分子及受體存在相互作用，可能在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起組織、聚集、調(diào)控信號分子的作用。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測RACK1在不同組織與細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在表達(dá)Mpl的細(xì)胞和組織內(nèi)RACK1的表達(dá)也很豐富；通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定了在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)RACK1同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用；隨后進(jìn)一步用激光共聚焦顯微鏡觀察RACK1與Mpl蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位、共定位，

5、發(fā)現(xiàn)兩者在細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)于相同位置，從而證明RACK1同Mpl蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用，并且這種相互作用可能具有一定的生理意義。另外我們還通過RNA干涉及基因的過表達(dá)等方法對RACK1在TPO受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)RACK1有可能參與Raf/MAPK通路的正調(diào)控。上述實(shí)驗(yàn)證明RACK1為一新的TPO信號調(diào)控分子并初步揭示了其在TPO受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能，這對完善TPO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、豐富RACK1的研究內(nèi)容都是很有意義的。

6、 Atp5d是ATP合成酶的δ亞基，在ATP合成酶中起定子的作用，保證亞基α3β3不隨γεcring一起旋轉(zhuǎn)。Atp5d游離存在時(shí)的功能研究非常少，證明其同Mpl胞內(nèi)區(qū)存在相互作用，對TPO信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Atp5d解離狀態(tài)時(shí)的功能等方面的研究都有重要意義。我們首先進(jìn)行了蛋白的原核表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上制備了Atp5d蛋白的多克隆抗體，經(jīng)過抗體特異性檢測，證明獲得了適用于Westernblot實(shí)驗(yàn)的特異性多克隆抗體；利用此抗體，檢測

7、了Atp5d在不同組織與細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Atp5d廣泛表達(dá)于心、腦、肝、脾、腎、骨髓等組織，其中心、肝、腎三組織的表達(dá)尤其豐富，而所檢測的細(xì)胞株中也都有豐富的表達(dá)。隨后利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)、pull-down實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)定位實(shí)驗(yàn)從不同角度證明了Mpl同Atp5d蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。最后構(gòu)建了一系列的Mpl缺失突變體和點(diǎn)突變體，利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)確定了Atp5d蛋白結(jié)合于TPO受體胞內(nèi)區(qū)第98-113氨基酸殘基區(qū)