噬菌體裂解酶PlyV12細胞壁結合域的功能及應用研究.pdf

1、抗生素的發(fā)現和使用極大地減低了因為細菌感染而導致的疾病發(fā)生率和死亡率。但是，隨著抗生素的廣泛使用，一些致病菌發(fā)生了耐藥突變，相繼出現了耐藥菌、多重耐藥菌以及超級耐藥菌。目前，細菌耐藥性已成為人類面臨的最大健康威脅之一。而另一方面，新型抗生素的研發(fā)又步履維艱。由于噬菌體裂解酶具有較好的殺菌特異性和不易產生耐藥性等特點，其有潛力發(fā)展為針對耐藥細菌的抗生素藥物，在近幾年得到了非常廣泛的關注和發(fā)展。一般來說,來源于革蘭氏陽性菌的噬菌體裂解酶的結

2、構域大致相似，具有一個決定該酶催化活性的N端催化域（enzymatic catalytic domain，ECD）和一個決定細胞結合位點的C端結構域（cell wall binding domain, CBD）。純化后的裂解酶可以從外部裂解革蘭氏陽性菌，而不能裂解革蘭氏陰性菌。其主要原因是革蘭氏陰性菌的肽聚糖（PG）層外還包有一層脂質層，噬菌體裂解酶不能透過該層，因而接觸不到其裂解底物肽聚糖層。
　　噬菌體裂解酶PlyV12是迄今

3、報道的天然裂解酶中抗菌譜最廣的裂解酶之一，于2004年由Pauline Yoong等首次報道，對糞腸球菌、屎腸球菌、化膿性鏈球菌及金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌均有較好的裂解活性，抗菌譜涵蓋了腸球菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬。但迄今為止并沒有報道PlyV12的細胞壁結合域確切區(qū)段，也沒有關于其細胞壁結合域結合譜的研究。因此，我們選定 PlyV12-CBD作為研究對象，希望通過其 CBD的廣譜結合特性去構建廣譜裂解活性的裂解酶，并利用PlyV

4、12-CBD對金黃色葡萄球菌細胞壁的強結合特性，對金黃色葡萄球菌表面進行改性，以調控其生物膜形成等生物學行為。本文主要研究工作和結果摘要如下：
　?。?）鑒定了噬菌體裂解酶PlyV12的細胞壁結合域，并研究了其相關性質。通過將噬菌體裂解酶PlyV12的C端三個截短蛋白與增強綠色熒光蛋白（EGFP）融合，觀察它們對金黃色葡萄球菌的染色效果，我們找到了PlyV12細胞壁結合域的具體區(qū)段為146 aa到314 aa這一區(qū)間；通過融合了E

5、GFP的PlyV12-CBD在金黃色葡萄球菌表面的吸附實驗及Scatchard方程,我們計算出PlyV12-CBD與金黃色葡萄球菌細胞壁結合常數 KD為2.5×10-7mol/L，PlyV12-CBD在單個菌體表面的結合位點高達9.4×106個；通過分析 EGFP-CBD對不同屬細菌細胞壁染色效果，我們還發(fā)現PlyV12-CBD結合譜相對較廣，涵蓋了腸球菌、鏈球菌和葡萄球菌；
　?。?）利用PlyV12細胞壁結合域的廣譜性，成功拓

6、展了裂解酶Ply187N的裂解譜。為了治療由多種病原菌引起的感染，研發(fā)具有一定抗菌廣譜性的嵌合噬菌體裂解酶具有重要意義。為此，我們構建了一個新的嵌合裂解酶Ply187N-V12C，這個裂解酶由金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶 Ply187的催化域（Ply187N）與屎腸球菌噬菌體裂解酶PlyV12的細胞壁結合域（146-314 aa, V12C）融合而成。實驗結果表明，這個嵌合裂解酶不但具備 Ply187N對金黃色葡萄球菌的裂解活性，并且將

7、Ply187N的裂解活性擴展到了鏈球菌和腸球菌，如S. dysgalactiae、S. agalactiae、S. pyogenes、E. faecium及E. faecalis。而嵌合之前的Ply187N對這些細菌沒有裂解活性。該工作表明通過將一個裂解酶的催化域與另一個裂解譜跨越幾個屬的裂解酶的細胞壁結合域融合，可以構建出具有較寬裂解譜的新型嵌合裂解酶；
　?。?）首次探索了PlyV12-CBD對于金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響

8、。金黃色葡萄球菌生物膜的形成與金黃色葡萄球菌引起的慢性感染有密切的聯系。由于噬菌體裂解酶PlyV12的細胞壁結合域（146 aa-314 aa）可結合所有測試金黃色葡萄球菌菌株，并且在金黃色葡萄球菌表面的結合位點數達9.4×106個。這些性質可以被利用來對金黃色葡萄球菌表面進行改性。因此，我們研究了PlyV12 CBD對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。實驗發(fā)現PlyV12 CBD明顯抑制了金黃色葡萄球菌生物膜的形成，而EGFP-CBD在

9、低濃度有一定的抑制作用，當濃度升高到一定程度后反而促進了生物膜的生長。我們推測PlyV12-CBD抑制金黃色葡萄球菌生物膜的特性應該與它結合細菌細胞壁及帶正電荷的特性有關。也就是說，帶正電荷的CBD中和了金黃色葡萄球菌表面的負電荷，這樣也就限制了帶正電荷的細胞間黏附多糖
　?。≒IA/PNAG）在細胞壁表面的吸附；對于高濃度的EGFP-CBD對金黃色葡萄球菌生物膜的促進作用，我們推測可能是EGFP-CBD濃度較高時其EGFP部分非