副溶血弧菌噬菌體的分離鑒定、裂解性能及其在副溶血弧菌快速檢測中的初步應(yīng)用.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio. parahaemolyticus)，又稱嗜鹽菌，廣泛分布在海水、淤泥以及魚蝦貝類等水產(chǎn)動物體內(nèi)，能引起蝦紅體病、魚類皮膚潰爛等水產(chǎn)動物疾病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的主要致病菌之一。人體食用被副溶血弧菌感染的水產(chǎn)動物，可引起急性腸胃病，若食物中副溶血弧菌含量超過106可引起敗血癥甚至死亡。據(jù)我國食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，副溶血弧菌引起的食物中毒的規(guī)模與人群暴露范圍已成為沿海省份微生物中毒的首要因素。
　　目前副溶血

2、弧菌的檢測方法主要分為傳統(tǒng)分離鑒定法與免疫學(xué)、核酸等現(xiàn)代檢測方法。傳統(tǒng)方法步驟繁瑣，檢測周期長，不能滿足水產(chǎn)品致病菌快速檢測的需要；現(xiàn)代檢測方法在檢測速度、靈敏性等方面有了很大提高，但是也存在樣品前處理復(fù)雜、儀器化程度高、檢測成本高等缺陷，尤其是不能實現(xiàn)目標(biāo)病原體的特異性檢測。建立一種快速、簡便、靈敏、特異性強的檢測方法有很重要的現(xiàn)實意義。本研究從篩選高效副溶血弧菌噬菌體出發(fā)，利用噬菌體的高度宿主專一性實現(xiàn)副溶血弧菌的特異性檢測，結(jié)合細(xì)

3、菌熒光素酶-FMN:NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系實現(xiàn)副溶血弧菌的快速檢測。主要研究內(nèi)容如下：
　　1、以副溶血弧菌VP17802為宿主菌，采用雙層瓊脂平板法從污水樣品中分離得到3株副溶血弧菌噬菌體VPp1、VPp2、VPp3，經(jīng)液體增殖法與固體增殖法增殖后該噬菌體的效價較高，能達(dá)1010pfu/mL以上。雙層瓊脂平板37℃恒溫培養(yǎng)12h后出現(xiàn)清晰透亮的噬菌斑。VPp1所形成的噬菌斑較小，邊緣模糊，有大而明顯的暈環(huán)，VPp2、VP

4、p3所形成的噬菌斑中等大，邊緣清晰，有較小或沒有暈環(huán)。
　　2、對VPp1、VPp2、VPp3進(jìn)行初步鑒定及電鏡觀察顯示，結(jié)果表明：VPp1、VPp2、VPp3分屬三株不同的噬菌體；遺傳物質(zhì)均為雙鏈 DNA；都有一個正二十面體的頭部，頭部直徑分別為44nm、64nm、89nm。VPp1無尾，屬蓋噬菌體科，VPp2、VPp3分別有一條114nm與106nm的尾部，屬于肌尾噬菌體科。
　　3、對VPp1、VPp2、VPp3進(jìn)行裂

5、解性能分析比較，結(jié)果表明：3株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)都比較小，分別為0.0001、0.00001、0.001；潛伏期分別為10min、5min、25min；裂解期分別為20min、25min、75min；裂解量分別為90.3、11.1、45.3。綜合分析各因素，發(fā)現(xiàn)VPp1是符合條件的潛伏期短裂解量大的理想噬菌體株系，因此選定VPp1用于后續(xù)實驗。紫外線照射實驗結(jié)果表明VPp1對紫外線非常敏感，照射20s存活率即下降60％以上，照射1 m

6、in存活率只剩下13%。VPp1全基因組序列包含64個推定基因，每個推定基因在數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果表明VPp1是一株新發(fā)現(xiàn)的噬菌體。
　　4、為了使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的NADH更多的釋放到胞外，本研究從噬菌體效價、裂解時間、噬菌體與宿主菌的體積比三個方面進(jìn)行噬菌體裂解宿主菌的裂解條件優(yōu)化，結(jié)果表明：噬菌體效價越高越能在短時間內(nèi)將宿主菌裂解完全，考慮到噬菌體增殖液制備的便利性，檢測體系中確定噬菌體的效價為1010pfu/mL；裂

7、解時間為15min；體積比為1:1。
　　5、將噬菌體VPp1結(jié)合細(xì)菌熒光素酶-FMN:NADH氧化還原酶體外發(fā)光體系進(jìn)行副溶血弧菌的定量檢測，結(jié)果表明：副溶血弧菌的數(shù)量在0.31×108~6.18×108cfu/mL范圍內(nèi)時，曲線的擬合方程為y=1938.3x+2906.1，兩者線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.9813，呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系；副溶血弧菌的數(shù)量在0.31×108~5.03×108cfu/mL范圍內(nèi)時，曲線的擬合方程為y=21

8、29.4x+2611.5，兩者線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.9954，線性關(guān)系良好。方法檢出限為2.64×107cfu/mL。在副溶血弧菌純培養(yǎng)液及牡蠣樣品中的平均加標(biāo)回收率分別為96.28%與91.92%，表明方法準(zhǔn)確度高，具有可行性。在VP純培養(yǎng)液及牡蠣樣品中的重復(fù)性試驗結(jié)果表明，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.72%與0.68%，均小于1%，表明該方法重復(fù)性好，精密度高。牡蠣樣品中的增菌檢測實驗結(jié)果表明，初始濃度為100cfu/mL的牡蠣樣