光學分子成像技術(shù)用于細胞治療與示蹤的研究.pdf

1、細胞治療以及器官移植作為可以修復或者代替受損器官的治療手段正在臨床中受到越來越多的重視和應用。但是對于細胞移植體內(nèi)后的存活、增殖、分化等行為的監(jiān)控技術(shù)卻極為有限。當前，主要的分析方法是組織切片和免疫組化染色，然而如何在活體水平上動態(tài)的觀察植入細胞的存活、增殖和分化等狀態(tài)仍然是一項亟待解決的重要課題。分子影像技術(shù)是近年來發(fā)展的一種化學、分子生物學、放射醫(yī)學以及計算機科學相結(jié)合的新興交叉學科，其具有活體、非創(chuàng)傷、實時的在細胞和分子水平上觀察

2、組織細胞行為的特點。當前，分子影像技術(shù)主要分為：放射性同位素成像、磁共振成像、生物發(fā)光成像以及熒光發(fā)光成像四種技術(shù)，它們在實際的應用過程中都有其各自的特點。其中，生物發(fā)光成像和熒光發(fā)光成像統(tǒng)稱為光學成像。由于其具有信號靈敏、檢測方便以及易于修飾等優(yōu)點逐漸成為生物學，醫(yī)學等領(lǐng)域研究的熱點。本論文所介紹的三項研究工作均是圍繞光學成像在細胞活體示蹤方面的應用來開展的。
　　本論文第一部分應用β-Actin-luc和Vegfr2-luc兩

3、種生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物并提取它們的胰島組織，鋪種到具有緩慢釋放肝素功能的絲素三維多孔支架中，隨后移植到一型糖尿病小鼠體內(nèi)，以期恢復正常的血糖水平并改善動物的生存狀況。通過血糖監(jiān)控及組織學評價，我們證明負載肝素的多孔支架在體內(nèi)可以明顯提高胰島在體內(nèi)的存活以及功能。同時，我們利用生物發(fā)光活體成像技術(shù)進一步評價材料在體內(nèi)發(fā)揮功能的機制。通過胰島的成像信號我們發(fā)現(xiàn)，絲素支架可以在體內(nèi)可以很好的保護胰島的存活，支架所釋放的肝素促進了胰島以及移植位點

4、的血管新生水平，同時體外血糖水平以及組織學檢測也證明了活體成像信號所反映的生物過程，這些結(jié)果都預示了生物發(fā)光成像技術(shù)在胰島移植以及組織工程材料體內(nèi)活性的評價中具有潛在的應用價值。
　　雖然生物發(fā)光技術(shù)具有很多優(yōu)點，但也有很多諸如細胞標記方法復雜和生物安全性未知等缺點。熒光成像（fluorescence imaging）具有成像信號強，易于標記，不受成像深度局限等特點，可以為細胞活體示蹤提供另一種具有應用前景的光學成像示蹤方法。目前

5、，傳統(tǒng)的熒光成像所應用的發(fā)光染料都存在著很多缺點以及問題。首先，在實際應用中，為了增強熒光信號通常會使染料聚集，但傳統(tǒng)的染料的熒光會隨著這個過程產(chǎn)生淬滅現(xiàn)象；其次，這些染料在激發(fā)光持續(xù)激發(fā)下發(fā)射的熒光會變得不穩(wěn)定并發(fā)生淬滅；另外，量子點等無機熒光材料對細胞毒性較大，且細胞駐留能力弱，容易隨著細胞分裂而造成信號丟失。這些缺點都限制了其在體內(nèi)示蹤細胞治療中的應用。
　　具有聚集誘導發(fā)光（AIE）特性的有機熒光染料近年來在生物醫(yī)學領(lǐng)域逐

6、漸受到越來越多的重視，它具有不同于傳統(tǒng)染料的優(yōu)越的光學性質(zhì)。本實驗首先基于AIE原理設(shè)計出一種新穎、高亮度的熒光納米粒子。我們通過體外實驗證明，這種納米粒子具有優(yōu)異的體外細胞示蹤性能和較低的細胞毒性。之后，標記的細胞被注射到小鼠下肢缺血的損傷組織中，通過活體成像技術(shù)追蹤干細胞在體內(nèi)的存活以及治療效果，并通過體內(nèi)體外一系列實驗來檢測納米粒子在體內(nèi)生物安全性，實驗結(jié)果證明這種新型熒光納米粒子可以在體內(nèi)精確、長期示蹤干細胞達1.5個月左右，就

7、我們所知是同類細胞示蹤產(chǎn)品中示蹤能力最高的，它們會為今后的干細胞體內(nèi)移植提供一種非常具有應用前景的追蹤方法。
　　共軛高分子（CPs）是一種擁有高自由度π共軛骨架的熒光高分子，它是新一代的有機熒光納米材料，具有良好的光穩(wěn)定性，亮度高，細胞毒性低。基于這些特性，CPs有希望成為另一種新型的細胞體內(nèi)示蹤染料。在論文第四章中，我們對于CPs染料在追蹤MSCs治療方面進行研究。首先將CPs用DSPE-PEG包裹后表面連接穿膜肽（Tat-p

8、eptide）以利于細胞滲透。然后，通過全層皮膚損傷的小鼠模型，探究了移植干細胞在組織愈合方面的治療作用。研究表明，CPs納米粒子在體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的細胞示蹤能力。納米粒子在細胞內(nèi)化過程中不破壞MSCs的增殖、遷移、分化和分泌方面的特性，并且可以長期體內(nèi)示蹤干細胞達21天左右。實驗表明，相比于商品化的量子點等示蹤產(chǎn)品，CPs納米粒子有著優(yōu)越的干細胞示蹤能力。它們可以作為一種新穎的外源性細胞示蹤探針，在認識干細胞治療的機制和探索細胞體內(nèi)行