小分子肽A34在重建P53抑癌功能中的作用和機(jī)制.pdf

1、背景和目的:
　　p53是重要的抑癌基因之一，iASPP是新發(fā)現(xiàn)的能特異性抑制p53正常抑癌功能的蛋白，我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，iASPP能通過與p53的結(jié)合，從而抑制p53的正常抑癌功能。因此，解除iASPP與p53的結(jié)合，釋放出游離的p53，可能是恢復(fù)或激活p53的正常抑癌功能的有效方法。本項(xiàng)目利用p53衍生肽A34能與p53競(jìng)爭(zhēng)iASPP結(jié)合位點(diǎn)的特性，采用報(bào)告基因、CHIP、體外轉(zhuǎn)錄翻譯、免疫共沉淀、流式細(xì)胞、移植瘤模型等

2、技術(shù)，從體內(nèi)體外兩方面研究A34與iASPP的相互作用，觀察A34過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡的影響以及對(duì)前凋亡基因表達(dá)和啟動(dòng)子活性的影響，闡明小分子肽A34在恢復(fù)和重建p53抑癌功能中的作用和機(jī)制。由于野生型p53存在于50％的人類腫瘤中，因此本課題的實(shí)施為使用小分子肽阻斷p53和iASPP的結(jié)合，恢復(fù)和重建p53抑癌功能提供了新的思路。
　　方法:
　　第一部分 小分子肽A34對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1.小

3、分子肽對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響:(1)針對(duì)于不同p53表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞U2OS、MKN-45、H1299、敲除p53基因的U2OS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染EX-GFP-MO1陰性對(duì)照質(zhì)粒和A34陽(yáng)性質(zhì)粒后，Annexin V-FITC/PI染色，雙染后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)小分子肽A34對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。(2)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染EX-GFP-MO1陰性對(duì)照質(zhì)粒和A34陽(yáng)性質(zhì)粒，DNA Ladder分析細(xì)胞凋亡。
　　2.小分子肽對(duì)腫瘤細(xì)

4、胞生長(zhǎng)增殖的影響:培養(yǎng)表達(dá)野生型p53腫瘤細(xì)胞U2OS，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1和陽(yáng)性質(zhì)粒A34，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　第二部分 小分子肽A34、iASPP、p53之間的相互作用
　　1.體外翻譯轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn):制備質(zhì)粒，構(gòu)建p53、iASPP、A34體外翻譯轉(zhuǎn)錄體系，免疫沉淀后用iASPP抗體、p53（DO-1）抗體、His抗體作為一抗做WB，檢測(cè)p53、iASPP、A34三者在體外的相互作用關(guān)系。
　　

5、2.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒A34，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞提蛋白，用iASPP抗體（自制）、His抗體及無(wú)關(guān)抗體做免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，用iASPP抗體、p53(DO-1)抗體、His抗體作為一抗做WB，檢測(cè)在細(xì)胞體內(nèi)A34、iASPP、p53三者之間的相互作用關(guān)系。
　　第三部分 小分子肽A34影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制
　　1.小分子肽對(duì)凋亡基因啟動(dòng)子Bax/Puma轉(zhuǎn)錄功能的影響:培養(yǎng)不同類型p53的腫瘤細(xì)胞U2OS、MK

6、N-45、U2OS(p53-/-)，準(zhǔn)備質(zhì)粒EX-GFP-MO1、A34、pGL3-basic-Baxpromoter、 pGL3-basic-Puma promoter、pRL-SV40，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到以上三種細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)Bax/Puma報(bào)告基因，檢測(cè)小分子肽對(duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　2.小分子肽與凋亡基因啟動(dòng)子Bax/Puma結(jié)合能力的影響:(1)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1和陽(yáng)性質(zhì)粒A34后做CHI

7、P實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小分子肽對(duì)Bax/Puma基因DNA片段結(jié)合的影響。(2)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1和陽(yáng)性質(zhì)粒A34，提RNA后轉(zhuǎn)cDNA，設(shè)計(jì)Bax、Puma引物做PCR實(shí)驗(yàn)，此實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)小分子肽對(duì)表達(dá)野生型p53的腫瘤細(xì)胞的Bax和Puma的mRNA影響。(3)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1和陽(yáng)性質(zhì)粒A34，轉(zhuǎn)染后提蛋白，用兔抗體bs-0127R和bs-1573R分別與Bax和Puma進(jìn)行免疫

8、沉淀實(shí)驗(yàn)，GAPDH作為上樣量對(duì)照，此實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)小分子肽對(duì)表達(dá)野生型p53的腫瘤細(xì)胞的Bax和Puma蛋白質(zhì)水平的影響。
　　第四部分 小分子肽A34對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響
　　1.胃癌MKN-45裸鼠移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(1)向四周大的BALB/C雄性裸鼠注入胃癌細(xì)胞MKN-45細(xì)胞懸液，構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。成瘤后隨機(jī)分組（每組不少于6只），每?jī)商煜蛄鲶w內(nèi)注射質(zhì)粒溶液并記錄瘤體的大小，注射六次后處死裸鼠并取瘤體，放入甲醛固定液中待

9、用，統(tǒng)計(jì)瘤體大小。(2)將取出的瘤體做石蠟包埋并做切片，切片后做HE染色。
　　2.骨肉瘤U2OS移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn):向四周大的BALB/C雄性裸鼠注入骨肉瘤細(xì)胞U2OS細(xì)胞懸液，觀察成瘤情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分 小分子肽A34對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1.AnnexinⅤ-FITC和PI雙染后，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)于轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒A34的表達(dá)野生型p53人骨肉瘤細(xì)胞U2OS和胃癌細(xì)胞MKN-45，凋

10、亡明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1和全空白的腫瘤細(xì)胞U2OS、MKN-45。
　　2.AnnexinⅤ-FITC和PI雙染后，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)于轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒A34的U2OS(p53-/-)和不表達(dá)p53蛋白的人肺癌細(xì)胞H1299，凋亡率與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1和全空白的腫瘤細(xì)胞U2OS（p53-/-）、H1299無(wú)明顯差別。
　　3.DNA Ladde分析細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒A34的入骨肉

11、瘤細(xì)胞U2OS的凋亡DNA片段明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒EX-GFP-MO1。
　　4.CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒A34的入骨肉瘤細(xì)胞U2OS增殖速度慢于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照EX-GFP-MO1和全空白的U2OS細(xì)胞。
　　第二部分 小分子肽A34、iASPP、p53之間的相互作用
　　1.體外翻譯轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，隨著A34質(zhì)粒由0-10μl增加到35μl，p53明顯減少，可見A34能競(jìng)爭(zhēng)iASPP結(jié)合p53，A34能與iAS

12、PP相互作用。
　　2.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，A34不與p53作用，但可與iASPP作用。
　　第三部分 小分子肽A34影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制
　　1.報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，在U2OS和MKN-45細(xì)胞中，小分子肽A34能提高p53對(duì)Bax/PUMA啟動(dòng)子的的轉(zhuǎn)錄活性，但對(duì)U2OS（p53基因-/-）細(xì)胞卻無(wú)此影響。
　　2.CHIP實(shí)驗(yàn)，通過抗p53抗體（DO-1）產(chǎn)生的免疫沉淀物，特異性地檢測(cè)到了啟動(dòng)子Bax和PUM

13、A的序列，但空白載體組IgG抗體產(chǎn)生的免疫沉淀物則無(wú)法檢測(cè)到這些序列?？瞻纵d體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中， Bax和PUMA啟動(dòng)子序列數(shù)量無(wú)變化。A34轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，Bax和PUMA啟動(dòng)子序列數(shù)量分別是空白載體組的1.54倍和1.34倍。
　　3.U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染A34后，Bax和PUMA的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平得到提高。
　　第四部分 小分子肽A34對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響
　　1.相對(duì)于M01處理組和生理鹽水處理組的腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，

14、A34處理組的腫瘤生長(zhǎng)速度減慢，由此表明A34能減慢移植腫瘤的生長(zhǎng)速度。
　　2.HE染色后，A34陽(yáng)性組可見壞死病灶。
　　結(jié)論:
　　本課題探討了小分子肽A34在重建p53抑癌功能中的作用和機(jī)制
　　1.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在p53表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染A34肽段可提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，p53缺失的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染A34則無(wú)明顯變化。因此，可推斷小分子肽A34是在腫瘤細(xì)胞p53表達(dá)的前提下，才可提高

15、細(xì)胞凋亡率。
　　2.通過DNA Ladder實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A34可提高腫瘤細(xì)胞凋亡率。
　　3.通過CCK8實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A34能降低腫瘤細(xì)胞增殖率。
　　4.通過體外翻譯轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)A34能完全與iASPP結(jié)合，繼而使p53從iASPP中游離下來。
　　5.通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)A34不與p53作用，但可與iASPP作用。即A34可以和p53競(jìng)爭(zhēng)與iASPP的結(jié)合，將p53游離出來。
　　6.通過報(bào)

16、告基因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)小分子肽A34增強(qiáng)凋亡基因啟動(dòng)子Bax和PUMA的轉(zhuǎn)錄活性這一功能是基于p53基因。
　　7.通過染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了A34具有增強(qiáng)p53與Bax/PUMA的DNA結(jié)合的能力的作用。
　　8.通過檢測(cè)U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染A34后Bax和PUMA的mRNA和蛋白質(zhì)水平，均表明A34能增強(qiáng)p53與DNA結(jié)合的能力，并提高Bax和PUMA的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。