蠐螬的活血化瘀作用及其機(jī)制初步研究.pdf

1、背景：
　　心血管疾病是目前醫(yī)學(xué)上的一種多發(fā)病，嚴(yán)重威脅到患者的身心健康。近年來，由于生活水平的提高，同時(shí)也由于環(huán)境的惡化，血管疾病發(fā)病成上升趨勢(shì)，并且成為目前中國(guó)人群的首要死因。血栓拴塞是心血管系統(tǒng)疾病的中常見的一類疾病，近年來嚴(yán)重危害人類健康，也是導(dǎo)致死亡率最高的原因之一，如心肌梗死、腦血栓、深靜脈血栓、腦拴塞、肺拴塞等。這些疾病都已經(jīng)成為危害人類生命和健康的重大疾病。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在40歲以上人群中，心肌梗死的發(fā)生率每年為3

2、9.7/10萬-64.0/10萬，腦卒中發(fā)生率每年為109/10萬。血凝和血栓形成是這一類疾病發(fā)病機(jī)制中涉及的重要的病理過程。因此，抗凝、預(yù)防血栓形成和將已形成的血栓溶解，已經(jīng)成為當(dāng)前臨床上對(duì)血栓性疾病的重要的防治方法。目前抗血栓藥主要包括抗凝血藥、纖維蛋白溶解藥和抗血小板藥三大類。目前在臨床上廣泛應(yīng)用的抗栓治療藥物多為尿激酶或者組織酶原激活劑，但是由于其價(jià)格昂貴，難以滿足治療和預(yù)防血栓病的需要。同時(shí)由于血栓拴塞性疾病的高發(fā)病率、高致殘

3、率和高死亡率，臨床上迫切需要療效高、毒副作用低的防治藥物，而現(xiàn)有的藥物均有不同程度的缺點(diǎn)。如尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等對(duì)于血栓栓塞性血管性疾病的溶栓治療，“有效時(shí)間窗”短成為一主要問題，且此難題在國(guó)際也未得到解決。針對(duì)以上情況，不少醫(yī)學(xué)同道尤其是中醫(yī)、藥界在這方面更是作出了艱辛的努力，雖然“中藥溶栓”療效目前還未得到醫(yī)學(xué)界公認(rèn)，但給人們提供了積極的啟示。例如通過調(diào)整中藥組方藥物的選擇、劑量的大小，配伍的原則和技巧，經(jīng)過多年的摸索、臨床

4、驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其“有效時(shí)間窗”比溶栓西藥延長(zhǎng)了，從實(shí)踐中看到了“中藥溶栓”的曙光。
　　昆蟲來源的藥物資源豐富，目前昆蟲來源的活性蛋白質(zhì)、多肽的研究已經(jīng)成為研究的一個(gè)新熱點(diǎn)。蠐螬，學(xué)名為東北大黑鰓金龜幼蟲，主要功效為破瘀、散結(jié)、止痛、解毒，作為一味中藥在中醫(yī)上有多種應(yīng)用，可以治療破傷風(fēng)、目中翳障、小兒丹毒等。另外，也有關(guān)于蠐螬用于活血化瘀的記載。《長(zhǎng)沙藥解》中記載:蠐螬，能化瘀血，最消塊?！毒V目》:蠐螬，《本事方》治筋急，養(yǎng)血地黃丸中

5、用之，取其治血瘀痹也。由此可見，蠐螬為行血化瘀的良藥。但是由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)蠐螬活性組分的研究極其貧乏，活血化淤的機(jī)制也不明確，極大的限制了蠐螬在活血化淤方面的使用。我們從蠐螬腸腔內(nèi)容物中獲取了其粗提取物，在下文中簡(jiǎn)稱“CEHDL”，嘗試從西醫(yī)藥理的抗凝溶栓角度來證實(shí)蠐螬的“活血化瘀”作用，并探索其抗凝溶栓機(jī)制及其活性組分的性質(zhì)。
　　目的：
　　1.從西醫(yī)藥理的抗凝溶栓角度來闡述蠐螬的活血化瘀作用
　　2.探索蠐螬提取物

6、抗凝溶栓的機(jī)制
　　3.初步鑒定蠐螬活血化瘀活性物質(zhì)的性質(zhì)
　　方法：
　　1.大鼠血漿復(fù)鈣化時(shí)間檢測(cè)蠐螬提取物體外抗凝活性
　　從SD大鼠腹主動(dòng)脈取血并獲得貧血小板血漿，分別與陰性對(duì)照組生理鹽水，蠐螬提取物四個(gè)劑量組(12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)混勻于37℃水浴孵育5分鐘，然后再加入氯化鈣溶液(25 mM)并搖勻，記錄從加入氯化鈣至液面凝固為止的時(shí)間，即為血漿復(fù)鈣化時(shí)間

7、。
　　2.小鼠尾靜脈出血時(shí)間檢測(cè)蠐螬提取物體內(nèi)抗凝活性
　　將30只昆明小鼠隨機(jī)分為5組。分好組后，每組內(nèi)小鼠尾靜脈注射生理鹽水，三個(gè)濃度的蠐螬提取物（10μg/g，20μg/g，50μg/g），以及尿激酶。2小時(shí)過后，剪斷小鼠尾靜脈尾端5 mm，測(cè)定每組小鼠尾靜脈出血時(shí)間。
　　3.體外血凝塊的溶解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蠐螬提取物溶栓活性
　　麻醉新西蘭家兔，心臟取血后待其自然凝固成血凝塊，然后將血凝塊分成大致相等的小份血

8、凝塊，分為5組，每組血凝塊分別與陰性對(duì)照生理鹽水，蠐螬提取物三個(gè)濃度組（200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml），尿激酶(100 u/ml)孵育。用倒置顯微鏡觀察每組溶液上清中因?yàn)檠ㄈ芙忉尫懦龅募t細(xì)胞數(shù)量，并拍照。12 h后，再分別根據(jù)血凝塊初始重量和末重之差來計(jì)算每組的溶栓率。
　　4.卡拉膠誘導(dǎo)的血栓模型檢測(cè)蠐螬提取物抗小鼠尾靜脈血栓作用
　　將32只昆明小鼠隨機(jī)分為4組，首先分別給予每組小鼠尾靜脈注射生

9、理鹽水，兩個(gè)濃度的蠐螬提取物（20μg/g，50μg/g），以及尿激酶。2h后，注射0.1％的角叉菜膠誘導(dǎo)尾靜脈血栓形成。24小時(shí)過后，統(tǒng)計(jì)每組小鼠尾靜脈血栓發(fā)生率，同時(shí)用卡尺測(cè)量每組內(nèi)發(fā)生血栓的小鼠尾靜脈血栓長(zhǎng)度，以觀察蠐螬提取物對(duì)小鼠尾靜脈血栓的影響。
　　5.測(cè)定蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白原的降解作用
　　通過SDS-PAGE凝膠電泳，觀測(cè)不同濃度的蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白原的降解作用，以及降解纖維蛋白原的三個(gè)亞基的順序

10、　　6.測(cè)定蠐螬提取物對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用
　　大鼠心臟采血后用離心的方法獲得貧血小板血漿和富血小板血漿，用血小板聚集儀測(cè)定富血小板血漿中加入不同濃度的蠐螬提取物時(shí)的聚集曲線，并計(jì)算其對(duì)5 min內(nèi)對(duì)最大聚集率的抑制率。
　　7.測(cè)定蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白的降解作用及其降解方式
　　用瓊脂糖做載體，用凝血酶激活纖維蛋白原變成纖維蛋白，制作成瓊脂糖纖維蛋白平板，再于85℃烘箱中烘烤30 min，制成滅活平板。

11、在做好的纖維蛋白平板上打孔加入樣品，根據(jù)加樣孔周圍有無溶圈形成及比較溶圈大小來判斷蠐螬提取物對(duì)纖維蛋白的降解作用及降解方式。
　　8.蠐螬提取物的初步分離純化及纖溶活性物質(zhì)性質(zhì)鑒定
　　蠐螬提取物的S-100HR分離純化后，通過與纖維蛋白原反應(yīng)后進(jìn)行凝膠電泳以檢測(cè)纖溶活性峰;通過觀察蠐螬提取物與分離材料DEAE sephadex-A50，CMSephadex-C50的結(jié)合判定其中纖溶活性物質(zhì)為陰離子還是陽離型;用Molish

12、反應(yīng)鑒定蠐螬提取物中是否含糖類。
　　9.測(cè)定蠐螬提取物纖溶活性的影響因素
　　通過SDS-PAGE凝膠電泳，觀測(cè)溫度、pH、金屬離子以及蛋白酶抑制劑對(duì)其纖溶活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.當(dāng)蠐螬提取物在血漿中的濃度達(dá)到25μg/mL以上時(shí)，可以明顯延長(zhǎng)血漿復(fù)鈣化時(shí)間，而且延長(zhǎng)效果隨著蠐螬提取物濃度的增加而增加，說明其具有良好的體外抗凝活性。
　　2.小鼠尾靜脈出血時(shí)間實(shí)驗(yàn)表明，給予小鼠注射蠐螬提取物后，

13、與陰性對(duì)照比較，可以明顯延長(zhǎng)小鼠尾靜脈出血時(shí)間，說明其具有良好的體內(nèi)抗凝活性。
　　3.在蠐螬提取物對(duì)血液形成的體外血凝塊的溶解實(shí)驗(yàn)中，隨著蠐螬提取物濃度的升高，因?yàn)槿芙庋龎K而釋放出來的血紅細(xì)胞數(shù)量明顯成增多趨勢(shì)，而且在12h后，測(cè)定的實(shí)驗(yàn)組的血凝塊溶解率也明顯高于陰性對(duì)照組，這表明蠐螬提取物可以溶解體外血凝塊，也說明其具有良好的體外溶栓活性。
　　4.蠐螬提取物可以明顯的降低角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾靜脈血栓發(fā)生率，同時(shí)可減短小

14、鼠尾部血栓長(zhǎng)度，說明其具有良好的體內(nèi)抗血栓活性。
　　5.凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明，蠐螬提取物可以降解纖維蛋白原，而且對(duì)與纖維蛋白原三個(gè)亞基均有降解作用，同時(shí)對(duì)于三個(gè)亞基的降解順序依次為α→β→γ，推測(cè)蠐螬提取物通過降解纖維蛋白原發(fā)揮抗凝作用。
　　6.蠐螬提取物可以輕度抑制ADP誘導(dǎo)的大鼠血漿聚集
　　7.在滅活纖維蛋白平板試驗(yàn)中結(jié)果顯示，蠐螬提取物周圍形成溶圈，表明蠐螬提取物自身可以降解纖維蛋白，并且降解作用也是隨著濃度的

15、增加而增加，但蠐螬提取物不能激活纖溶酶原，因此蠐螬提取物是通過自身降解纖維蛋白而發(fā)揮溶栓作用。
　　8.蠐螬提取物纖溶性物質(zhì)經(jīng)S-100HR分離純化后在Ⅱ峰，纖溶性物質(zhì)為陰離子型，且不含糖類。
　　9.蠐螬提取物纖溶活性物質(zhì)在75℃以上失活，說明為蛋白酶類，并且其纖溶活性可以被絲氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，EDTA對(duì)其纖溶活性無影響，說明其纖溶活性成分含有絲氨酸蛋白酶但不含金屬蛋白酶;并且其在(pH3.0～pH10.0)范圍內(nèi)

16、均能保持活性，而且各種金屬離子（Mg2+，Ca2+,Zn2+，F(xiàn)e2+,Fe3+，Cu2+）對(duì)其纖溶活性幾乎無影響。
　　結(jié)論：
　　1.蠐螬提取物可以延長(zhǎng)血漿復(fù)鈣化時(shí)間和小鼠尾靜脈出血時(shí)間，同時(shí)可以溶解體外血凝塊，這說明其具有良好的抗凝和溶栓活性，從而達(dá)到活血化瘀功效。
　　2.蠐螬提取物主要通過降解纖維蛋白原和直接降解纖維蛋白而發(fā)揮抗凝溶栓的作用。其對(duì)纖維蛋白原的三條鏈均有降解作用，并且降解順序?yàn)棣痢隆?但不能