鈦材表面仿生多層結(jié)構(gòu)促骨形成及分子機(jī)制研究.pdf

1、鈦及鈦合金由于其機(jī)械強(qiáng)度高、良好的生物相容性和耐腐蝕性能，在臨床骨科和牙科硬組織修復(fù)中廣泛應(yīng)用。然而，鈦基植入體仍存在松動(dòng)、移位等現(xiàn)象，導(dǎo)致植入失敗，其主要原因在于植入體難以與宿主周邊骨組織形成功能性緊密結(jié)合（或骨整合）。因此，針對(duì)骨整合缺乏而導(dǎo)致植入失敗的臨床挑戰(zhàn)，亟需發(fā)展新的研究思路及技術(shù)手段，以提高鈦基植入體表面的骨形成，加速其體內(nèi)植入后骨修復(fù)過(guò)程。
　　鈦基植入在體內(nèi)骨整合修復(fù)過(guò)程中面臨復(fù)雜微環(huán)境諸多因素（細(xì)胞外基質(zhì)組分、

2、活性氧、血管形成等）。在不改變植入體整體物理性能前提下，通過(guò)適宜表面改性，賦予其生物功能性，調(diào)控骨修復(fù)微環(huán)境，促進(jìn)植入體骨形成能力，對(duì)新型生物功能化骨修復(fù)植入體研發(fā)有重要的科學(xué)意義及潛在臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。本論文從模擬天然骨多層結(jié)構(gòu)出發(fā)，利用層層組裝技術(shù)（Layer-by-Layer assembly technique,LBL），在鈦材表面仿生構(gòu)建了具有促骨/血管形成及抗氧化性能的插層多層結(jié)構(gòu)生物活性界面，促進(jìn)鈦基植入體-骨組織界面的修復(fù)過(guò)

3、程，提高植入體的骨形成能力，同時(shí)深入探究了其潛在的分子調(diào)控機(jī)制。本文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　?、倩趦翰璺樱瓪ぞ厶牵–hi-C）多層結(jié)構(gòu)的構(gòu)建及其促骨修復(fù)研究
　　在成功合成兒茶酚-殼聚糖（Chi-C）和羥基磷灰石納米纖維（HA nanofibers，HA）的基礎(chǔ)上，以Chi-C和Gel（明膠）分別作為聚電解質(zhì)，以羥基磷灰石納米纖維作為插層組分，通過(guò)LBL技術(shù)在鈦基材表面構(gòu)建仿生多層膜結(jié)構(gòu)，并利用接觸角測(cè)試、掃描電鏡（

4、SEM）和原子力電鏡（AFM）等表征材料的表面特性。進(jìn)而，在改性鈦基材表面接種成骨細(xì)胞，評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞功能的影響。細(xì)胞骨架染色和掃描電鏡觀察結(jié)果表明，細(xì)胞可在改性鈦基材表面更好的粘附和鋪展。細(xì)胞活性、堿性磷酸酶活性、天狼猩紅、茜素紅以及成骨特異性基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的多層膜結(jié)構(gòu)可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性、I型膠原分泌、細(xì)胞外基質(zhì)礦化水平以及成骨分化特異性基因的表達(dá)，顯示出其較強(qiáng)的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化能力。進(jìn)

5、一步利用兔股骨缺損模型，評(píng)價(jià)了鈦基植入體體內(nèi)促骨損傷修復(fù)能力，最大推出力檢測(cè)結(jié)果顯示其骨整合效果增強(qiáng)，X-射線和μCT影像學(xué)，以及H&E染色、Masson染色和免疫組化學(xué)染色等組織學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，多層膜結(jié)構(gòu)顯著提高鈦基材表面骨形成，并有較高的血管化密度。
　　②兒茶酚－殼聚糖（Chi-C）多層膜結(jié)構(gòu)的抗氧化保護(hù)作用和機(jī)制研究
　　在本部分研究中，首先利用 H2O2處理，在體外構(gòu)建成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，進(jìn)而研究多層膜結(jié)構(gòu)的

6、抗氧化保護(hù)能力以及潛在分子機(jī)制。細(xì)胞粘附結(jié)果表明，基于Chi-C構(gòu)建的多層膜結(jié)構(gòu)可減弱氧化應(yīng)激對(duì)成骨細(xì)胞初始粘附的損傷；胞內(nèi)活性氧自由基（ROS）檢測(cè)表明，多層膜結(jié)構(gòu)可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平；qRT-PCR和Western Blotting結(jié)果顯示，H2O2處理會(huì)引發(fā)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，如粘附和抗凋亡相關(guān)基因或蛋白水平降低、以及促凋亡相關(guān)蛋白水平的升高，而Chi-C多層膜結(jié)構(gòu)則可以通過(guò)清除ROS，降低ROS對(duì)成骨細(xì)胞的相關(guān)損傷，從而達(dá)到

7、對(duì)成骨細(xì)胞的保護(hù)作用。
　?、鄹男遭伝谋砻娉晒欠只统裳芑舱{(diào)控的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　在體外成功分離脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，Ad-MSCs）的基礎(chǔ)上，在改性鈦基材表面接種Ad-MSCs和人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs），考察其體外促成骨分化和成血管化調(diào)控效應(yīng)。相關(guān)Ad-

8、MSCs實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多層膜結(jié)構(gòu)可促進(jìn)Ad-MSCs的粘附、鋪展、遷移、增殖以及成骨分化，與細(xì)胞粘附和遷移相關(guān)蛋白、以及SDF-1/CXCR4軸信號(hào)通路密切相關(guān)。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)上調(diào)了 Ad-MSCs的血管相關(guān)因子VEGF和SDF-1的基因表達(dá)和蛋白旁分泌水平。而HUVECs接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多層膜修飾的鈦基材顯著促進(jìn)HUVECs的粘附、鋪展和遷移，上調(diào)細(xì)胞粘附、遷移和成血管相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，利用Tranwell系統(tǒng)共培養(yǎng)Ad-MSCs

9、和HUVECs，結(jié)果表明，接種在改性鈦基材表面上的Ad-MSCs旁分泌效應(yīng)會(huì)促進(jìn)共培養(yǎng)體系中HUVECs的遷移和成微管等成血管功能；而接種在改性鈦基材表面上的HUVECs成血管因子SDF-1分泌水平上調(diào)，同時(shí)對(duì)共培養(yǎng)體系中Ad-MSCs的遷移以及成骨分化能力也發(fā)揮促進(jìn)作用。
　?、芨男遭伝谋砻娉晒欠只统裳芑舱{(diào)控的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　在本部分研究中，首先構(gòu)建大鼠皮下植入模型和股骨缺損植入模型；然后利用組織病理學(xué)檢測(cè)，結(jié)果

10、顯示，多層膜修飾的鈦基材在組織損傷修復(fù)早期（7d）會(huì)增強(qiáng)植入體表面細(xì)胞的增殖能力、間充質(zhì)干細(xì)胞募集能力和血管化密度；在移植28天后，在皮下和股骨組織中，多層膜結(jié)構(gòu)表面改性的鈦基植入體表面呈現(xiàn)更多的骨樣組織，以及較高水平的成骨晚期標(biāo)志物OCN和OPN表達(dá)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，無(wú)論是皮下植入（骨異位）還是股骨植入（骨原位），表面改性的鈦基材都可顯著提高植入體表面的骨形成。
　　綜上，基于骨組織的結(jié)構(gòu)特征以及骨修復(fù)過(guò)程中所面臨的多重復(fù)雜微

11、環(huán)境因素，本論文基于仿生思路，利用LBL技術(shù)在鈦基材表面構(gòu)建了一種具有促骨修復(fù)的仿生多層膜結(jié)構(gòu)。多層膜結(jié)構(gòu)可通過(guò)清除骨植入部位微環(huán)境中的活性氧、改善局部骨損傷修復(fù)微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖以及分化功能發(fā)揮。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，多層結(jié)構(gòu)不但可直接影響接種在鈦基材表面Ad-MSCs或HUVECs的生理功能，調(diào)控相關(guān)細(xì)胞的成骨分化或成血管化，而且可通過(guò)接種在鈦基材表面的Ad-MSCs（或HUVECs）的旁分泌效應(yīng)，間接調(diào)控共培養(yǎng)體系中的HUVECs（或