bFGF促鈦表面成骨細(xì)胞分化成骨作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察鈦片上成骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài);記錄不同濃度bFGF，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)成骨細(xì)胞MTT、ALP等的影響，研究不同濃度的bFGF對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及成骨的影響并從中篩選出bFGF作用于成骨細(xì)胞的最佳濃度;運(yùn)用western-blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化，推測(cè)bFGF在鈦表面促細(xì)胞分化、成骨的機(jī)制;通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.將成骨細(xì)胞接種于表面粗化處理的鈦片上

2、，體外進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。采用掃描電鏡觀察鈦片表面形態(tài)及成骨細(xì)胞在鈦表面生長(zhǎng)情況;采用MTT法對(duì)比各組成骨細(xì)胞在第1至第5天細(xì)胞增殖情況;檢測(cè)第4天，第8天及第12天各組ALP的活性;檢測(cè)第6天，第12天，第18天及第24天各組OC的OD值。對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析得出促成骨細(xì)胞在鈦表面增殖、分化及成骨的最佳bFGF濃度及將最佳bFGF濃度組與對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.將成骨細(xì)胞接種于消毒的玻片及鈦片上，體外進(jìn)行培養(yǎng)。采用

3、細(xì)胞免疫熒光法，鏡下觀察對(duì)比最佳bFGF濃度組與對(duì)照組Runx2、OPG及BMP-2蛋白的熒光強(qiáng)度并攝片;采用western-blot法觀察各組Runx2、OPG、BMP-2、p-Akt及Akt蛋白條帶及在各組中添加PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002后各個(gè)蛋白的條帶變化。對(duì)最佳bFGF濃度組及對(duì)照組的蛋白條帶結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)掃描電鏡的鏡下觀察，處理過(guò)的鈦片表面粗糙、高低不平。通過(guò)成骨

4、細(xì)胞在鈦表面的鏡下觀察，見(jiàn)細(xì)胞在鈦表面生長(zhǎng)良好，粗糙的鈦表面有利于成骨細(xì)胞的早期附著及鋪展。成骨細(xì)胞在粘附及鋪展完成期間基本可見(jiàn)三種形態(tài)，且成骨細(xì)胞在24h內(nèi)基本完成粘附，48h后可以完成細(xì)胞的鋪展并發(fā)揮其作用。
　　2.細(xì)胞增殖情況:成骨細(xì)胞在鈦表面第1至第5天的MTT吸光值（OD值），間接反映了細(xì)胞的增殖情況。bFGF組OD值高于對(duì)照組，10ng/ml至40ng/ml濃度的bFGF組的OD值隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，40n

5、g/mlbFGF濃度的OD值達(dá)到最大，隨后呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。因此，40ng/mlbFGF濃度在鈦片上促細(xì)胞增殖的效果最佳且高劑量的bFGF濃度對(duì)成骨細(xì)胞反而出現(xiàn)一定程度的抑制。
　　3.細(xì)胞分化及成骨作用的情況:各組在第8天時(shí)對(duì)成骨細(xì)胞促分化的作用強(qiáng)于其他時(shí)間點(diǎn)，且無(wú)論在任何時(shí)間點(diǎn)bFGF實(shí)驗(yàn)組ALP活性均大于對(duì)照組。各濃度中，以40ng/ml濃度作用效果最佳。根據(jù)骨鈣素檢測(cè)的結(jié)果得出，在各組中第18天時(shí)骨鈣素分泌含量達(dá)最大值，且b

6、FGF實(shí)驗(yàn)組大于對(duì)照組。各bFGF濃度中，以40ng/ml作用效果最佳。ALP及OCN檢測(cè)結(jié)果與MTT結(jié)果一致且將ALP及OC的40ng/mlbFGF組與對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.根據(jù)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，40ng/mlbFGF組的Runx2，OPG及BMP-2蛋白信號(hào)強(qiáng)度大于對(duì)照組且鏡下細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組。鏡下發(fā)現(xiàn)，40ng/mlbFGF組的成骨細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，與對(duì)照組相比，

7、細(xì)胞形態(tài)呈梭形且更加細(xì)長(zhǎng)。對(duì)于western-blot實(shí)驗(yàn)，40ng/ml濃度的bFGF作用下，Runx2,OPG，BMP-2與p-Akt蛋白表達(dá)均大于其他組，且bFGF組大于對(duì)照組。因此，bFGF能促成骨細(xì)胞在鈦片分泌蛋白，40ng/ml的濃度效果最佳。根據(jù)40ng/mlbFGF實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的各個(gè)蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　5.在各組中加PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制劑LY294002

8、后，通過(guò)western-blot法檢測(cè)，Runx2，OPG，BMP-2與p-Akt蛋白表達(dá)均被抑制，其中40ng/mlbFGF組抑制最為明顯，且與對(duì)照組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.bFGF能促進(jìn)成骨細(xì)胞在鈦表面的增殖、分化及成骨的作用且能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌相關(guān)蛋白。其中40ng/ml濃度的bFGF作用效果最佳。
　　2.bFGF能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路增強(qiáng)成骨細(xì)胞在鈦表面的分化及成骨作